单克隆抗体制备

本章内容单克隆抗体概念、特性、与多克隆抗体的异同点？杂交瘤技术的基本原理杂交瘤细胞的克隆方法单克隆抗体的制备流程和应用第一页，共四十四页。概念多克隆抗体（PcAb）：针对抗原不同表位的多个B淋巴细胞克隆产生的混合抗体单克隆抗体（McAb）：只针对抗原单一表位的B淋巴细胞克隆产生的同源抗体第二页，共四十四页。为何要使用单克隆抗体？一个抗原分子可能含有许多抗原表位一个B细胞只会生产一种抗体传统抗血清对相似抗原会有交叉反应性第三页，共四十四页。一个抗原分子上常有许多表位抗原分子上可以诱导出抗体的部位或片段，称为eptope、antigenicdeterminant；一个抗原分子上通常都有许多eptope，每个eptope至少都可诱生出一种抗体；因此在传统抗血清中，都含有许多种不同的抗体，分别针对这些不同的eptope。第四页，共四十四页。一个B细胞只会生产一种抗体

血清中的每一种抗体是由单一种B细胞所分泌产生，若能把此B细胞由脾脏中挑出来，单独培养成细胞株，则可获得单一种类的抗体，只会对一种eptope反应。大量培养此细胞株，即可有品质一定、纯度均一的抗体，即单克隆抗体。第五页，共四十四页。抗血清对相似抗原会有交叉反应性对于分子构造相似的抗原，由于它们含有共同或相似的eptope，所产生的抗血清对这两种相似的抗原都会产生反应，称为交叉反应性。同时又由于免疫动物的个体差异，对抗原的反应也有相当的差异，以致无法准确控制所得到每批抗血清效价的高低第六页，共四十四页。抗血清和单克隆抗体制备

第七页，共四十四页。B细胞无法在培养基中生长

B细胞不易在培养基中生長，虽然有人一直努力，想找出在体外培养脾脏细胞的条件，但结果均不甚理想。(見图中央的4号B细胞，X表示无法培养)第八页，共四十四页。肿瘤细胞可在培养基中永久生长

肿瘤细胞可在培养基中永久生长：若把瘤细胞永久生长的特性，利用细胞融合技术导入可生产抗体的B细胞中，则得到可在培养基中永久生长的B细胞株，即杂交瘤细胞株。

第九页，共四十四页。

1975年Koehler和Milstein在Nature杂志联名发表题为“分泌预定特异性抗体的融合细胞持续培养“的论文，宣告单克隆抗体的诞生，该成果获1984年诺贝尔医学奖和生理奖.

第十页，共四十四页。杂交瘤技术制备单克隆抗体第十一页，共四十四页。杂交瘤技术的基本原理

杂交瘤技术是将能够产生抗体，但在体外不能进行无限繁殖的B淋巴细胞与能在体外进行无限繁殖，但不能产生抗体的骨髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞。这种杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性：既能够分泌特异性的抗体，又能够在体外长期繁殖。杂交瘤细胞经过筛选、克隆化培养后成为单个细胞克隆，分泌的抗体即为单克隆抗体。

第十二页，共四十四页。单克隆抗体制备流程图第十三页，共四十四页。亲本细胞的选择与制备细胞株稳定，易传代培养；细胞株本身不产生Ig是次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转换酶缺陷株(hypoxanthine-guaninephosphoribosyltransferase,HGPRT)最常用的骨髓瘤细胞是NS-1和SP2/0细胞株骨髓瘤细胞(NS-1)骨髓瘤细胞需定期用8-氮鸟嘌呤(8-AG)处理第十四页，共四十四页。亲本细胞的选择与制备免疫脾细胞：是经过抗原诱导活化的免疫细胞，具有分泌抗体的能力

8-12周龄BALB/c小鼠先以目标抗原(如菌体)免疫，抗原需加佐剂(adjuvant）注入小鼠体内慢慢释出，诱使B细胞成熟增殖并生产抗体。试采血确定有抗体产生后，即可取出

脾脏以收集脾脏细胞(大多为B细胞)与骨髓瘤细胞进行细胞融合。

注意乳剂的生产要完全，可取小量滴入水中，震动后应该不会散去。

有人打开腹腔直接在脾脏注射抗原免疫。但除非抗原来源困难或有其它目的，我们仍采用传统方法，因免疫反应的启动机制非常复杂，生物整体的免疫反应是最可靠的。

第十五页，共四十四页。第十六页，共四十四页。第十七页，共四十四页。第十八页，共四十四页。第十九页，共四十四页。细胞融合小鼠脾细胞B

与NS-1细胞N

以PEG

进行融合，操作在2min內完成。PEG可导致细胞膜上脂类物质的物理结构重排，使细胞膜容易打开而有助于细胞融合。第二十页，共四十四页。

第二十一页，共四十四页。第二十二页，共四十四页。常见的几种融合形式第二十三页，共四十四页。细胞DNA合成途经第二十四页，共四十四页。HAT选择培养基三种关键成分：

次黄嘌呤（hypoxanthine,H）

氨基蝶呤（aminopterin,A）

胸腺嘧啶（thymidine，T）◆是根据细胞内嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸的生物合成途径设计的用于筛选杂交瘤细胞的特殊培养基。

第二十五页，共四十四页。

叶酸参与DNA合成过程，而氨基蝶呤是叶酸的拮抗剂，能阻断该合成途径。◆HAT培养基中含有叶酸拮抗剂-氨基蝶呤，故所有细胞DNA合成的主要途径均被阻断，只能通过替代途径合成。◆杂交瘤细胞从脾细胞中获得HGPRT，同时又继承了骨髓瘤细胞长期生长繁殖的特性，能够在HAT培养基中得以生存而被筛选出来。第二十六页，共四十四页。核苷酸从头合成途径（denovosynthesis）核苷酸氨基碟呤（A）HAT核苷酸补救合成途径（salvagesynthesis）次黄嘌呤（H）胸腺嘧啶核苷（T）DNA第二十七页，共四十四页。筛选方法初步筛选：融合后马上以HAT培养，能活下来的都是B细胞与NS-1的正确融合细胞，但此时细胞的遗传背景尚未十分稳定。

筛选特异性抗体：

并非所有B细胞都会产生我们所要的抗体，小鼠原先就存在许多B细胞株对抗一般疾病；因此要用酶联免疫分析法（ELISA）挑出特异性抗体第二十八页，共四十四页。第二十九页，共四十四页。阳性杂交瘤细胞的克隆化克隆化

从抗体阳性孔中分离出单个细胞进行培养，使之繁殖成单一细胞集落的过程。有限稀释法：最常用的方法显微操作法荧光激活细胞分选法软琼脂平板法第三十页，共四十四页。

有限稀释法计数103/ml102/ml10/ml0.5-2/孔第三十一页，共四十四页。将阳性孔细胞株稀释，重新平分到96孔细胞培养板中，以计算使得每孔中只含有一个细胞（例如每mL含有100个细胞，若只要取一个细胞放到一个培养孔中，那你应该吸取多少mL？0.01mL），待其生长成群落后，再次以ELISA筛选特异性抗体。第三十二页，共四十四页。克隆化需至少进行3-5次第三十三页，共四十四页。阳性杂交瘤细胞的冻存目的：保证杂交瘤细胞不会因污染或过多传代变异丢失染色体而丧失功能。冻存液：10%-90%小牛血清+10%二甲亚砜（DMSO），1X106-5X106/0.5mL逐步降温:-800C过夜,再放入液氮第三十四页，共四十四页。单克隆抗体生产小鼠体内诱生法：先向小鼠腹腔注射降植烷，一周后把挑选出来的杂交瘤细胞打入小鼠腹部，诱生肿瘤，然后以针头收集所产生的腹水，通常可取得15mL左右；腹水中的抗体浓度非常高，每mL可达数mg。

2)体外增量培养法：把杂交瘤细胞在大型培养槽中培养，收集培养液上清即得抗体，但每mL只得约数mg，浓度较腹水稀约一千倍。最近有一种细胞培养瓶，可产生如腹水般浓度的上清，但价格极为昂贵(IBSIntegraBioscience:IntegraCelline)。第三十五页，共四十四页。第三十六页，共四十四页。第三十七页，共四十四页。第三十八页，共四十四页。单克隆抗体的性质鉴定Ig类型测定特异性测定效价测定结合表位测定亲和力测定染色体分析第三十九页，共四十四页。第四十页，共四十四页。单克隆抗体的特性高度特异性高度的均一性和可重复性弱凝集反应和不呈现沉淀反