通过放空阀排出气泡培训资料

通过放空阀排出气泡1)正确认识、处理HPLC的泵、柱、检测器

三者的关系：(1)HPLC是一个系统；必须将泵、柱、检测器三者（三个部件）结合起来才能叫HPLC仪器；泵、柱、检测器三者都合格，联机后的整机系统才有可能合格，但不能肯定系统就会合格。只有泵、柱、检测器三者质量都合格，并且联机后检测结果也合格，才能说明这台HPLC是合格的。(2)三个部件都重要，不能偏重哪一方面。三者谁是核心？谁最重要？目前，光谱、色谱工作者对此看法都各不相同、各有表述。我们不必去追究这些；本人认为应该说三者是一个整体，缺一不可，都很重要。(3)本人长期使用过HPLC，也研发过多种HPLC仪器[1]，实践使我深深认识到：必须将三个部件联接起来检验测试，并能达到整机质量指标要求，才能说这台HPLC达到了质量要求（合格）。否则，只能说是部件合格，整机不一定能合格。为什么？因为：①泵会因为柱子问题产生压力不稳、流量不稳定，会影响HPLC系统的质量；②柱对泵影响很大；柱堵塞、柱沾污、柱接头漏液等，都会影响泵的压力波动、使流速不稳定；会影响系统不稳，使RSD变坏、峰拖尾、灵敏度降低；③柱对检测器影响很大：柱效降低（柱塔板数降低）、柱堵塞、柱的新旧程度、接头、管道漏液等，都会影响检测器的检测限、分辨率、噪声、和灵敏度。所以，泵、柱、检测器各个部分单独都合格，但是联接在一起时，可能会因为柱外效应（卡套、接头、气泡、干扰、进样器等）会影响系统的各项指标，导致整机不合格。2）目前制造和使用中普遍存在的问题和解决

方法（1）过去我国很多公司在生产和检验HPLC

中普遍存在的问题：一般都是将泵、检测器单独生产、单独自检、单独送质检部门检测；经质检部门检测后和未经检测的外购柱一起出厂，对使用者来说，等于买了三个部件，自己组装后使用。

。在用户那里，因为条件所限，三者联机后会经常出现很多“问题”；其实这些“问题”都是应该在制造、检测过程中得到合理解决的问题，但是，这些问题移植到了用户那里。由于用户那里没有条件解决这些问题，于是就将这些“问题”都怪罪于仪器的质量，这很不科学、很不公平。这可能是我国HPLC经常在用户那里“出问题”、影响国产HPLC声誉的主要原因之一。解决办法就是制造厂将泵、柱、检测器三者联合在一起测试，保证联机测试合格才算合格、才能出厂。(2)目前国内外某些企业，生产、检验HPLC

时还未解决的问题：生产车间将检测器和泵两个部件分开自检后送质检部门检验。但质检部门将泵、检测器和“工装柱”三者联机检验。然后将泵、检测器和未经检测的外购柱，三者成套出厂。本人认为：我们这样做，存在很大的问题，不符合仪器学理论[2]的要求。我们不能用通用“工装柱”检验HPLC系统，原因见上述“②、③”所述。请注意：色谱柱是易损件，用户会经常在色谱柱长时间使用后换新柱，此时HPLC系统的泵和检测器基本进入“电子元件失效理论的盆底[1]、[2]”，比较稳定了。所以，不会因为换新柱而产生仪器不能使用的问题。但是特别应该指出的是：用户换新柱后，一般不检测系统的综合指标；如果检测指标，可能仪器就不能达到原出厂指标（因为泵和检测器经过较长期使用后，质量会有所下降，旧泵、新柱、旧检测器三者不能达到最佳配备）。用户换新柱不会影响使用的问题，可以从计量认证标准规范（JJG）得到佐证；JJG检验的仪器，很多是在用仪器，它明确规定被检仪器的指标可以比新出厂的仪器指标低，甚至有些指标因为达不到要求而免检。但我们的制造企业，在仪器出厂前，必须检测指标，只有系统指标达到设计要求时，才算合格，才能出厂。至于用户换新检测器、换新泵，同样都是允许的。但是，如果要求检测换新泵或新检测器后整机系统的指标，则仍然必须要配换新柱；必须是合格的新柱、新检测器、新泵，三者联机检测指标。否则，会由于系统的泵、柱、检测器因使用时间长而指标下降，会使HPLC系统的检测结果达不到出厂要求或不合格。此时用户会怪罪制造公司，认为是仪器不合格，这实在太不公平。

解决上述问题的方法：HPLC生产者应该采取的正确做法：泵、柱、检测器三者联起来检验，三者同时入库（编号），三者成套出售。这样才能保证仪器在用户那里的质量。2、使用者应该对色谱柱及柱外的有关

问题引起高度重视（制造者在制造过程中也应该重视）1）色谱峰拖尾：与柱、流动相的流速、试样等有关，发现拖尾一定要从这些方面查找原因；2）如何延长色谱柱寿命：保养很重要，长期不用时用甲醇浸泡着；严格控制洗柱时间或溶剂体积；一般经常使用的柱，下班时应该洗45分钟或洗20倍床体积的溶剂；3）必须注意对“柱外效应”的控制：所谓“柱外效应”,就是指HPLC系统中，除柱系统外，管路、连接件、进样器和流动池的死体积等引起的色谱峰增宽效应。4)进样：

自动进样时，应该经常检测自动进样器；对仪器的进样器要求稳定可靠；手动进样时，应该特别注意取样时的细节；进样时的手感（轻、重、缓、急）等。3、HPLC的研发制造者和使用者应该

特别注重对色谱柱质量的判断

1）色谱柱的柱效：塔板数高者好；特别要

注意影响柱效的因素；塔板数降到一

定程度该柱就报废了。2）重复性：一根柱子反复使用时，最好RSD能够保持小于0.1%。3）耐用性(寿命)：因为柱效很容易降低，

所以需要重视对柱的保护。4）色谱柱使用后一定要进行清洗，以免

造成腐蚀、阻塞、降低塔板数。一般应该用20倍床体积的溶剂冲洗；隔几天再用的HPLC，最好用20%甲醇：80%水冲洗30分钟左右后，再用纯甲醇冲洗20分钟后保存[2]。4、HPLC的研发、制造、使用者应该

特别重视流动相问题1）PH值特别重要：一般的C18柱在PH值

小于3时，容易损坏色谱柱。但是抗酸

性的柱可以使用小的PH值。2）注意选择试剂的截止波长[2]：如乙腈215截止波长215nm、丙酮截止波长330nm、正丁烷210nm等。3）流速：流速要适当，否则影响峰形、浪

费溶剂；一般常规分析工作大多选择1ml/min。5、使用者应该注重溶剂前处理

最好使用HPLC级的优质溶剂；使用前必须过滤和脱气。注意以下几点：1）过滤目的：溶剂进泵前和样品注射前应该过滤除去溶剂中的微小颗粒、微生物，保证泵和色谱柱不会堵塞或损坏，保证分析数据可靠。2）对过滤器的要求和最佳孔径选择方法：对过滤器总的要求：速度快、溶出度小、死体积小、精确的孔径、体积适当、化学兼容性好等。最佳孔径选择方法：如果色谱柱填料直径小于3µm或除菌过滤，一般选择0.2µm孔径；如果色谱柱填料直径大于5µm，则选0.45µm；如果是预过滤或过滤难过滤的样品，一般选1µm孔径。特别是对使用无机盐配制的缓冲液，更要注意选择合适的过滤器！否则，不可能得到可靠的分析测试数据！3）脱气：主要目的是：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡；液相色谱流动相脱气使用较多的是离线超声波振荡脱气、在线惰性气体鼓泡吹扫脱气和在线真空脱气。流动相的气泡进入液相泵会引起压力的上下波动，危害很大。必须除之；可以打开排空阀，大流速冲洗。6、使用者应该注重缓冲液问题1）

缓冲液使用前必须过滤2）

溶剂、样品易受到细菌和霉菌的影响，

要注意清洁。

3）一般不能直接用有机溶剂做清洗冲洗。4）梯度洗脱时，选低吸收值的缓冲液：

例如：梯度洗脱时，缓冲液与有机相应预混，以防止析盐；在保证峰不拖尾的情况下，尽可能选用低浓度的缓冲盐，防止析盐；缓冲盐浓度，一般用20～30mM基本上就可以了，如果流动相中有机相含量高的话，流动相中的盐类缓冲液浓度就不能过高，盐的浓度起码要保证在流动相条件下不会析出。离子对缓冲液浓度要高一点，一般50～100mM。7、检测器问题1）最常用的检测器主要有四种（紫外、荧光、光

蒸发散射和质谱）;紫外检测器覆盖面约70%；荧光检测器覆盖面约12%；蒸发光检测器（包括示差折光检测器）覆盖面约8%左右；质谱8%左右；其它2%）。紫外检测器的波长问题：一般固定254nm或可变波长被常用；但是可变波长较好；2）噪声：直接影响分析误差；应该经常检测之；3）漂移：它是影响稳定性的主要内容内容之一；4）灵敏度（或检测限）：应该经常自己检测，保

证HPLC系统的检测限；23现象原因判断排除方法（1）压力过高色谱柱柱头被堵塞；色谱柱性能下降或柱有一定堵塞；加保护柱；或换柱或冲洗柱在线式过滤器堵塞；用30%的稀硝酸，放在超声波仪器上清洗10分钟；再用纯水超声10分钟即可链接管路阻塞冲洗，必要时更换进样阀阻塞用进样体积10倍的流动相冲洗进样阀；30分钟以上流动相使用不恰当改用恰当的流动相柱温太低升高温度

8、特别需要重视使用中的12个常见技术问题

（分为：“现象”、“原因判断”、”排除方法”；都是我的经验教训的总结，时间关

系，今天我这里只是简单提一下，准备放到分析测试百科网上；供大家参考。）24现象原因判断排除方法（2）压力过低管道系统或柱接头部位漏液检查漏液位置并拧紧泵中存在气泡排气单向阀脏污清洗单向阀泵流速设定太低提高移动相流速柱温过高降低柱温25现象原因判断排除方法（3）压力不稳定或压力波动大泵头内有气泡A、通过放空阀排出气泡；b、用针筒通过放空阀抽出气泡单向阀不正常清洗或更换单向阀管路堵塞清洗或更换管路管路漏液A、拧紧漏液处的螺丝；B、更换失效部分气泡存在于溶剂过滤头的管路中A、振动过滤头排除气泡；B、流动相脱气现象原因判断排除方法（4）泵能正常运行，但无溶剂流出气泡从输液入口进入泵头拧紧泵头入口压帽泵头中存在空气在泵头中灌注流动相，打开放空阀，在最大流量下开泵，直到没有气泡出现单向阀方向颠倒按正确方向安装单向阀单向阀已坏更换单向阀溶剂储液瓶已空灌满储液瓶现象原因判断排除方法（5）泵流速变小泵内有气泡打开放空阀，让泵在高流速下运行，排除气泡溶剂过滤器堵塞打开泵头入口压帽，如果溶剂不能很快流出输入管，说明过滤器堵塞，需要清洗或更换泵中有两种溶液不互溶用一种介于两种溶剂之间的过渡溶剂，来溶解两互不溶解的溶剂柱塞密封泄露更换柱塞密封压缩补赏调节失灵检查或更换（参考说明书）现象原因判断排除方法（6）泵不吸液泵内有气泡排放气泡入口单向阀堵塞检查、更换出口单向阀堵塞检查、更换单向阀方向颠倒调换单向阀方向泵头损坏按说明书维修现象原因判断排除方法（7）流速过高流速补赏失灵检查或更换（按说明书）PC板失灵维修或更换PC板（按说明书）压缩补赏调节失灵检查或更换（按说明书）（8）泵有嗡嗡响声，不能正常启动电机失灵停泵检查线电压过低提高线电压（或用稳压器）现象原因判断排除方法（9）流量不稳，时高时低泵头内有气泡打开放空阀，让泵在高流速下运行，排除气泡泵中溶剂分层使用过渡溶剂，来使两者互溶泵头松动拧紧泵头，固定螺丝输液管路漏液或部分堵塞分断检查管路进行排除

现象

原因判断排除方法（10）开机后有柱压，但没有流动相从检测器流出系统中严重漏液修理进样阀或泵与检测器之间的管路和固紧件流路堵死消除进样器口、进样阀或柱与检测器之间连接毛细管或检测池的微粒柱入口端被微粒堵塞清洗或更换柱入口过滤片；或换色谱柱；过滤所有样品和溶剂（11）柱压升高，流量减小色谱柱、保护柱堵塞清洗或更换柱入口过滤片或更换色谱柱检测器或检测器的入口管部分堵塞拆卸并清洗检测池和管路32（12）保留时间变化问题（分析数据重复性差）:现象、原因及其解决方法液相系统分析样品时未达到平衡使保留时间变化。解决办法：平衡系统室温波动大，使保留时间变化。解决办法：使用柱温箱柱被污染使保留时间变化；解决办法：清洗之进样体积太大或样品浓度太高使保留时间变化。；解决办法：减少或稀释流动相组份变化使保留时间变化。解决办法：认真检查，解决之气泡影响流动相脱气不够充分使保留时间变化。解决办法：，排气(脱气)9、

结论影响HPLC仪器质量的因素、影响HPLC使用者的分析误差的因素都很多，远不止今天所讲。这就需要制造者、使用者认真学习仪器学理论；因为仪器学理论像一把金钥匙，一通百通；它会使制造者、使用者知其然知其所以然，它可以保证制造者做出优质仪器，可以保证使用者将仪器用到最佳水平、得到最佳分析数据。

10、几点体会

1）必须打破误区！正确对待进口和国产HPLC仪器！

有人迷信进口仪器说：“进口仪器总比国产仪器好”。我说：不对！这是一个误区！

过去…；都不行！

现在…；常规、基础、普及型仪器都不错；我国对各类HPLC需求量每年达10000台以上！虽说国产HPLC质量上各有千秋，但是基本上都能满足使用要求！我们要正确评价HPLC仪器！（请参考我的专著）

有些高端仪器我国目前还不行，但是高端仪器市场小，赚钱不多；我们要从民族高度看问题！要严防上当！既不要盲目媚外，也不要盲目排外！

2）应该大胆使用能满足要求的国产HPLC仪器：

今天我国的常规、基础分析仪器不比同类进口仪器差！已经完全可以与国外抗衡（指标优于、相当、不够）。特别是HPLC这类常规仪器，我们国家目前有20多家在生产！虽说仪器的水平、质量等各有千秋！但是，要看到“抗衡”这个问题！我们千万不要迷信进口仪器！今天，我从仪器学理论和分析化学的实践相结合的角度、从使用的适用性角度、从仪器的可靠性和性价比角度等方面