无菌操作与培养用液

无菌操作技术与培养用液

一、细胞培养操作基本要领和要求防止污染是决定培养成败的首要条件。培养前准备准备各种所需物品（宁多勿少）；用品置于场地，然后消毒操作野消毒

现多用紫外线灯灭菌，效果很好。洗手和着装洗手用75%酒精或0.2%的新洁尔灭无菌操作培养操作动作准确敏捷不用手触及已消毒物品操作面布局合理操作保持一定顺序组织或细胞在未做处理前或培养液在未用前，勿过早暴露在空气中；用过之后如不再重复使用，应立即封闭瓶口。防止各种用液的交叉污染不向操作野讲话或咳嗽一、消毒细胞培养的最大危险是发生培养物的细菌、真菌和病毒等微生物的污染常见原因：操作间或周围空间的不洁培养器皿和培养液消毒不彻底由于有关培养的每个环节的失误均能导致培养失败，故细胞培养的每个环节都应严格遵守操作常规，防止发生污染消毒灭菌方法物理消毒灭菌法紫外线：用于空气，操作台表面和不能使用其它法进行消毒的培养器皿。

消毒时间：30min（至少）紫外杀菌功能除了紫外本身以外，还可以由产生的臭氧来完成。紫外灭菌以后，最好过一个小时再进去。

过滤：0.22μm（适用于液体）湿热（高压蒸气灭菌法）15磅,121℃，20min各种物品有效消毒压力和时间不同，一般要求如下：

培养用液、橡胶制品l0磅l0分钟布类、玻璃制品、金属器械等15磅20分钟干烤：160℃,2小时（适用于玻璃器皿等）注意：消毒后不要立即打开箱门，以防止冷空气骤然进入引起玻璃炸裂，影响消毒效果。化学消毒灭菌法7５%酒精主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内的壁面处理1－２‰新洁尔灭主要用于器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒抗生素主要用于培养用液灭菌或预防培养物污染在细胞培养中最常用的抗生素是青霉素（常用浓度是100u/ml）与链霉素（100μg/ml）。建议不要在原代培养中加入抗生素

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培养用液是维护组织细胞生存、生长及进行细胞培养各项操作过程中所需的基本溶液。主要包括平衡盐溶液

培养基

其他培养用液

天然培养基合成培养基细胞培养用液第一节水和平衡盐溶液1、水：细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜(一周内）的三蒸水或纯净水

2、平衡盐溶液（balancedsaltsolution,BSS）

组织细胞培养中常用的基本液体，可以维持渗透压、调节pH值、供给细胞生存所需的无机离子成分；用于洗涤组织、细胞等几种常用的平衡盐溶液：主要由无机盐、葡萄糖组成

Ringer、PBS、Tyrode、Earle、Hank’s、D-Hank’s、Dulbecco（都有相应配方）最简单的BSS是Ringer。D-Hank’s与Hank’s的一个主要区别在于前者不含有Ca2+、Mg2+

，因此D-Hank’s常用于配制胰酶溶液。配制平衡盐溶液也应当用新鲜的三蒸水。配好的平衡盐溶液可以过滤除菌或高温高压灭菌。有浑浊或沉淀时，应重新配制

PBS（Phosphate-BufferedSallines）KCl0.20gKH2PO40.20gNaCl8.00gNa2HPO4·7H2O2.16gDPBS（Dulbecco’sPhosphate-BufferedSallines）标准型CaCl2(anhyd.)(无水氯化钙)0.10gKCl0.20gKH2PO40.20gMgCl2·6H2O0.10gNaCl8.00gNa2HPO4·7H2O2.16gD-Hanks’

平衡盐溶液(D-HanksBalancedSaltSolutions,D-HBSS)KCl0.40gKH2PO40.06gNaCl8.00gNaCO30.35gNa2HPO40.048gD-Glucose1.00gPhenolRed0.01g

第二节培养基培养基就是人工模拟细胞在体内生长的营养环境，维持细胞生长的营养物质,它是提供细胞营养和促进细胞生长增殖的物质基础细胞培养基的基本要求:体外培养的细胞直接生活在培养基中，因此培养基应能满足细胞对营养成分、促生长因子、激素、渗透压、pH等诸多方面的要求。

一、培养基中主要的成分包括：1.氨基酸：精氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸和缬氨酸（均为Ｌ型）。

2.碳水化合物：葡萄糖

3.维生素：叶酸、肌醇、烟酰胺、吡哆醛、核黄素、硫胺素等。

4.无机离子与微量元素：

1、天然培养基：即组织提取物和体液。如血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等。

2、合成培养基:需要添加血清培养细胞。3、无血清培养基

不需要添加血清就可维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。二、培养基的分类：市场上可提供干粉培养基和液体培养基干粉培养基需使用者自己配制并灭菌，其优点是价格便宜。缺点是配制过程比较繁琐，质量不易控制液体培养基是由专业厂家按标准规模化生产，不仅质量得到保证，而且使用十分方便，但比较昂贵。常用的培养基种类RPMI-1640（标准型）、DMEM-高糖（标准型）、DMEM-低糖（标准型）、McCoys5A、M199、F10等三、如何选择培养基？(1)建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞首选的培养基。(2)本实验室惯用的培养基(3)根据细胞株的特点、实验的需要来选择培养基(4)用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据试验结果选择最佳培养基四、培养基的配制：

（1）认真阅读说明书。（2）配制时要保证充分溶解，NaHCO3、谷氨酰胺等物质都要在培养基完全溶解之后才能添加。（3）配制所用的水应为三蒸水，离子浓度很低，水电阻达30万Ω以上。（4）所用器皿应十分洁净。（5）配制好的培养基应马上过滤，无菌保存于

4℃。

DMEM培养液的配制（举例）(溶解)900mLddH2O于1000mL烧杯中，将DMEM粉1包倒入其中，盛粉袋用50mLddH2O分次冲洗，也倒入容器，磁力（或玻棒）搅拌溶解。（调PH）用5％－10％的NaHCO3调pH至7.2（加抗生素）加青、链霉素至终浓度100u/mL和100ug/mL（过滤除菌）用0.22um的滤膜过滤除菌。（分装保存）分装（200mL左右）后4℃冰箱保存。

血清：细胞在单纯的基础培养基中不能存活,基础培养基中常常要添加血清，添加血清后的培养基被称为“完全培养基”。血清终浓度多为5％－20%。最常用的是10%。

广泛应用的血清种类有马血清与牛血清，后者又分为胎牛血清、新生牛血清与小牛血清。胎牛血清应取自剖腹产的胎牛；新生牛血清取自出生24小时之内的新生牛；小牛血清取自出生10～30天的小牛

血清的主要作用

(1)提供基本营养物质

(2)提供贴壁和扩展因子

(3)提供激素及各种生长因子

(4)提供结合蛋白

(5)对培养中的细胞提供某些保护作用细胞培养中使用血清的缺点(1)有可能改变某种细胞在体内的正常状态(2)血清中含有一些物质对细胞会产生毒性作用(3)每批血清之间都有差别,其成分不能保持一致。(4)取材过程有可能带入支原体、病毒，对培养的细胞产生潜在影响(5)直接影响某些实验，如生长因子的检测血清的使用与储存

(1)使用前的处理：血清在使用前通常在

56℃加热30分钟，这一过程称为灭活。

热灭活目的：灭活血清中的补体成分。

对于一些品质高的胎牛血清和新生牛血清可以考虑不经灭活直接用于细胞培养。（２）储存条件：血清一般储存于－20℃,同时应避免反复冻融

大包装的血清，首先将血清灭活处理，然后分装为小包装，如10ml、20ml、50ml，储存于-20℃，使用前融化。融化后的血清在4℃不宜长时间存放，应尽快使用。血清中的沉淀物絮状物：血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成，这些絮状物不会影响血清本身的质量。可用离心3000rpm,5分钟去除，也可不用处理显微镜下“小黑点”：经过热处理过的血清，沉淀物的形成会显著增多。有些沉淀物在显微镜下观察象“小黑点”，常误认为血清受污染。一般情况下，此小黑点不会影响细胞生长，但如果怀疑血清质量，则应立即停止使用，更换另一批号的血清其他培养用液

１、消化液

（1）胰酶(trypsin)溶液：浓度一般为0.1％～0.25％配制时要用不含Ca2+、Mg2+及血清的平衡盐溶液

（2）EDTA溶液：使用浓度为0.02%；可与胰酶的混合使用

一种化学螯合剂，对细胞有一定的离散作用，而且毒性小，价格低廉，使用方便常用工作液浓度为0.02%。

注意：使用EDTA处理细胞后，要用平衡盐液冲洗干净，因残留的EDTA会影响细胞生长EDTA溶液配制：用D-Hanks’

平衡盐溶液溶解后，高压蒸汽灭菌，分装成小瓶，4℃冰箱保存（3）胶原酶(collagenase)溶液：使用浓度为0.1～0.3mg／L或200000U／L，作用的最佳pH为6.5。胶原酶不受Ca2+、Mg2+及血清的抑制，配制时可用PBS。

胶原酶作用温和，不易对细胞产生损伤。在上皮类细胞原代培养时经常使用缺点：价格昂贵

２、谷氨酰胺补充液

合成培养基中必需成分，但容易降解，所以都是在使用前添加。谷氨酰胺使用终浓度为0.002mol/L。一般配制为100倍浓缩液，配制时应加温至30℃，完全溶解后过滤除菌，分装至小瓶，储存于-20℃。3、pH调整液常用的有HEPES液

NaHC03NaHCO3

溶液（常用）常用浓度为7.5%。配制时用三蒸水溶解后，过滤除菌或高压灭菌，分装，4℃保存(NaHCO3遇热不稳定,会分解释放出CO2)HEPES（分子量238.31）溶液一种弱酸，中文名字是羟乙基哌秦乙硫磺酸，对细胞无毒性防止培养基pH迅速变动。主要作用:防止培养基pH迅速变动。在开放式培养条件下，观察细胞时培养基脱离了5%CO2的环境，CO2气体迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此时可以维持pH7.0左右。一般在进行克隆化培养时要添加HEPES使用终浓度一般为10-50mmol/L常配成1M储存液：用20ml双蒸水溶解4.76克HEPES，过滤除菌或高压灭菌，分装小瓶，4℃保存。使用时可向100ml培养液中加入2mlHEPES浓缩液，终浓度为20mmol/L４、抗生素液青、链霉素的配制及使用浓度青霉素80万U加Hank’s液至80mL，浓度1万u/