DNA条形码技术在生物分类学鉴定中的应用市公开课金奖市赛课一等奖课件

1、DNA条形码技术在生物分类学中应用DNA Barcoding in the identification of medicinal plants第1页一、序言二、DNA条形码概念及原理三、DNA条形码标准及优点 四、DNA条形码操作及分析方法五、DNA条形码在植物中研究现实状况六、DNA条形码在药用植物判定中应用主要内容第2页一、序言 长久以来生物分类学家一直在寻找能够快速区分不一样物种方法。自卡尔-林奈对生物物种进行系统分类以来，生物学家利用各种各样性状颜色、外形和行为等形态或者解剖学特征传统分类学来判定动物和植物，这些特征往往对形态近似种判定较网难，且可能出现错误。 最近数十年，研究者开始

2、利用DNA中携带遗传信息来完成这个任务。DNA条形码(DNA barcoding)技术是一个利用短DNA片段对物种进行识别和判定新分子生物学技术，是生物学近期研究热点之一。第3页二、DNA条形码概念及原理 DNA Barcoding概念由加拿大动物学家Paul Hebert首次提出。DNA条形码技术(DNA barcoding)是利用标准、有足够变异、易扩增且相对较短DNA片段(DNA barcode)本身在物种种内特异性和种间多样性而创建一个新生物身份识别系统，它能够对物种进行快速自动判定。第4页DNA条形码原理：DNA是生物遗传信息载体，遗传物质不一样，决定了生物多样性。因为每种生物物种D

3、NA序列都是唯一，就给DNA条形码提供了物质基础。因为部分碱基保守性，几十个碱基长度不能提供足够编码信息，所以当前DNA条形码分析都是基于几百个碱基长度DNA序列。第5页DNA条形码技术（,Herbert）是经过对一个标准目标基因DNA序列进行分析从而进行物种判定技术。这个概念原理与零售业中对商品进行识别商品条形码是一样。简单地说，DNA条形码技术关键就是对一个或一些相关基因进行大范围扫描，进而来判定某个未知物种或者发觉新种。 自从提出DNA条形码概念以来，这种新兴分类学技术已经引发了越来越多生物学家关注。 DNA条形码技术是分类学中辅助物种判定新技术，它代表了生物分类学研究一个新方向，所以它

4、在生态、环境、食品等很多领域都将会有广泛应用。第6页DNA条形码技术产生和发展Tautz等 首先提出利用DNA序列作为生物分类系统主要平台，即DNA分类学(DNA taxonomv)观点。初，Hebert等首次提出用一个基因序列作为判别不一样物种条形码，并选中C01基因。随即探讨该技术在鸟类分类判定中可行性他们工作推进了条形码技术在生物物种判定中应用。3月，20多位分类学家、分子生物学家和生物信息学家汇聚美国冷泉港召开了题为“Taxonomy and DNA”会议提出对全球全部生物物种某个特定基因进行大规模测序以期实现物种判定目标进而推进生物进化历史研究。同年9月，在冷泉港再次召开题为“Tax

5、onomvDNA and the barcode of life”会议对DNA条形码判定全部真核生物科学性、社会利益有了更深入探讨。而且提出了组织策略及国际生物条形码计划(International bareode of life projeet)发展蓝图。第7页，加拿大圭尔夫大学(University of Guelph)Paul Hebert教授提出了“DNA条形码”概念。将条形码技术引入生物界。其思想产生于当代商品零售业条形编码系统。将超市用以区分成千上万种不一样商品条形码概念引入，利用A、T、C和G 4个碱基在基因中排列次序识别物种，他们把这种小片段基因序列称作物种DNA条形码（DNA

6、 barcodes），并提出为全球生物编码计划。Paul Hebert教授率先于选取线粒体细胞色素C氧化酶亚基I(cytochrome c oxidase subunit 1，c01)作为动物中通用物种判定标识，并提出DNA条形码定义：经过使用短标准DNA片段，对物种进行快速、准确识别和判定。 Paul Hebert等对动物界包含脊椎动物和无脊椎动物共11门13320个物种线粒体细胞色素c氧化酶亚基1（Cytochrome coxdase I，CO I）基因序列比较分析,发觉98%物种遗传距离差异在种内为0%-2%，种间平均可到达11.3%，据此提出能够用单一小片段基因来代表物种。当前，DNA

7、条形码技术在很多动物分类群中得到了成功应用第8页秋，美国国立生物技术信息中心(NCBI)与生命条形码联盟(CBOL)签署合作。物种条形码标准DNA序列及其相关数据将存档于GenBank。随即，GenBank提供C01序列数快速增加突出表现在除脊索动物之外各类群C01序列数量剧增当前脊索动物分类基本上都已经完成。年2月。伦敦举行了第一届全球DNA条形码会议对DNA条形码分类理念、试验技术细节分析以及资料库建立等议题进行了讨论。最终目标是联合各个类群DNA条形码数据库组建一个全球生物DNA条形码数据库将此数据库设置在GenBank中让公众能够自由登录查询。第9页DNA条形码技术原理DNA条形码技术

8、是经过对一个标准目标基因DNA序列进行分析从而进行物种判定技术。DNA序列由A，T，C。G 4种碱基组成假如有n个碱基，就会有4n种编码方式。假如按照这个公式计算。15个碱基位点就能出现近10亿种编码序列这个数字是现存物种100倍。因为自然选择原因。一些位点上碱基是同定从而造成可能编码组合数降低。这能够经过只考虑蛋白编码基因来处理因为在蛋白编码基因里。因为密码子简并性其第三位碱基通常都不受自然选择作用影响，是自由改变。一个长度300bp蛋白质编码基因核苷酸片段在第三密码子位点含有100个核苷酸这些位点上发生替换通常都是中性选择而且大多数都是经过随机漂变在种群中固定下来。在这100多个位点上就存

9、在4 100种可能性为随即序列比对分析提供了较大可能性。伴随分子生物学技术飞速发展取得100多个碱基序列变得非常轻易。第10页理想DNA条形码应该符合以下标准 含有足够变异性以区分不一样物种。 同时应含有相正确保守性，方便于用通用引物进行扩增。 必须是一段标准DNA区来尽可能判别不一样分类群。 目标DNA区应该包含足够系统进化信息以定位物种在分类系统(科，属等)中位置。 目标DNA区应该足够短，方便有部分降解DNA扩增。三、DNA条形码标准及优点第11页三、DNA条形码标准及优点Kress等()和Taberlet等()提出了理想DNA条形码标准：(1)能够区分物种足够变异和分化，同时种内变异必

10、须足够小；(2)有高度保守引物设计区方便于设计通用引物；(3)片段足够短，方便于DNA提取和PCR扩增，尤其是对部分降解DNA扩增。第12页，由Alfred Sloan 基金会赞助，在美国华盛顿特区举行了一个关于DNA 条形码大型研讨会，此次会议创建了生命条形码联盟(CBOL,the Consortium for the Barcode of Life)。生命条形码联盟阐述了DNA条形码优点：(1)以DNA序列为检测对象，生物DNA是由遗传信息决定，所以同种生物不一样生长时期DNA序列信息是相同，即使经过加工，形态发生改变，DNA序列信息不会改变，较之传统方法，扩大了检测样本范围；同时样本部分

11、受损也不会影响识别结果。(2)可进行非教授物种判定。只要设计一套简单试验方案，经过简单培训技术员即可操作。第13页(3)准确性高。特定物种含有特定DNA序列信息，而形态学判别特征会因趋同和变异造成物种判定误差。(4)经过建立DNA条形码数据库，可一次性快速判定大量样本。分类学家新研究结果将不停地加入数据库，成为永久性资料，从而推进分类学科愈加紧速深入地发展。第14页四、DNA条形码操作及分析方法DNA条形码操作过程与分子生物学试验类似，包含采集材料并提取DNA、利用通用引物PCR扩增目标片段、纯化PCR产物、序序列测定与分析以及提交结果到相关数据库。条形码应用目标是全部物种，而且每个物种需要多

12、份材料。采集材料时应以传统形态分类学知识为依据，尽可能地涵盖传统分类学中变异式样。通常认为每个物种最少需要10份材料，并最好包含5个不一样居群。第15页DNA提取 依据样品不一样，能够采取不一样提取方法，比如CTAB法、Trizol QiagenDNeasykit等 (DoyleJJ， DoyleJL.1987)设计通用引物 普通情况下，能够经过分析NCBI和GenBank数据库中DNA序列，在模板保守区内利用专业软件设计引物。第16页第17页PCR扩增以样品DNA为模板，利用通用引物进行扩增。不一样序列有不一样PCR程序。有时需要在试验中调整PCR程序，才能得到目标序列。普通而言，假如样品D

13、NA纯度高且完整，则有利于PCR进行。假如样品DNA有较为严重降解现象，能够依据基因叶绿体trnL (UAA)内含子短片段重新设计通用引物，有利于序列扩增。第18页全新4通道实时荧光定量PCR仪 普通梯度PCR仪第19页PCR扩增原理引物延伸延伸5533变性、退火变性、退火第20页基因组DNA获取特定DNA片段扩增特定DNA片段第21页基因组DNA引物DNA聚合酶DNA片段体外扩增第22页琼脂糖凝胶电泳 用于检测PCR扩增效率，选取扩增效果好样品，进行单向或双向测序。测序原理 当前用于测序技术主要是Sanger于1977年创造双脱氧核糖核酸链末端终止法。第23页这种测序方法是依据核普酸在某一固

14、定点开始，随机在某一个特定碱基处终止，而且在每个碱基后面进行荧光标识，产生以A、T、C、G结束四组不一样长度一系列核普酸，然后在尿素变性PAGE胶上电泳进行检测，从而取得可见DNA碱基序列。基本原理是每个反应含有全部四种脱氧核营酸三磷酸 (dNTP)使之扩增，并混入限量一个不一样双脱氧核普三磷酸(ddNTP)使之终止。因为ddNTP缺乏延伸所需要3一OH基团，使延长寡聚核普酸选择性地在G、A、T或C处终止，终止点由反应中对应双脱氧而定。第24页第25页第26页序列分析生物条形码工程首要目标是建立可用来作为判定标本工具基因序列数据库。当前只建立了动物条形码数据库，植物条形码尚处于评定阶段，只有该

15、技术在植物中深入完善后才有可能建立对应数据库。序列数据分析是DNA条形码探索最主要步骤，因为植物种间杂交现象比较普遍，所以植物条形码分析方法也处于不停探索中。第27页当前报道序列分析方法基本分为以下几步：(1)序列比对和人工校正。普通采取Clustal W，生命条形码数据库中使用Hidden Markov Models行序列比对，也能够BLAST search在Genbank中搜索相同基因片段对比片段信息可靠性。(2)遗传分析。植物条形码需要对不一样片段种间和种内变异进行对比，以选择最正确片段或片段组合。种间距离基本采取Kimura-2-parameter distance(K2P)模型计算。

16、理想DNA条形码检测到种间遗传变异应显著大于种内遗传变异。(3)系统学分析。采取标准系统学分析方法，建立系统发生树，检验同一个物种不一样个体能否聚在一起。第28页第29页第30页五、DNA条形码在植物中研究现实状况在植物中DNA条形码研究进展相对迟缓，主要有两方面原因：(1)植物线粒体基因组进化速率较慢，遗传分化小，所以动物中标准片段COI不适适用于植物；(2)系统学研究中惯用片段变异较小，不适适用作条形码片段(Chase et al.,;Kress etal.,)。因为核基因组通常含有多拷贝特征，且物种内变异较大，引物通用性差，而且扩增时对模板DNA质量要求高，不适适用于存在DNA降解材料(

17、Kress et al.,)，所以，植物中最可能条形码还是从叶绿体基因组中选择(Chase et al.,;Cowan et al.,)。第31页生物条形码联盟(CBOL)最初提议植物条形码片段均为叶绿体段：matK，rpoC1，rpoB，accD，nhdJ和YCF5。但因为后3个片段在一些主要植物类群中有缺失，如YCF5在苔藓类植物中缺失，accD在禾本科植物中缺失，而ndhJ在松属植物中缺失，所以它们在第二阶段更新中已被排除。因为越来越多研究表明单靠某一个片段不太可能对全部植物物种进行准确判定，研究者又相继提出了不一样片段组合方案。第32页片段组合方案最早由Kress等()提出 。Kres

18、s等()经过对53科88属99个物种9个质体基因片段(trnK-rps16、trnH-psbA、rp136-rps8、atpB-rbcL、ycf6-psbM、trnV-atpE、trnC-ycf6、psbM-trnD和trnL-trnF)和核基因ITS序列进行分析，提出了片段组合方案,并预测ITS+trnH-psbA组合将在有花植物(flowering plants)中有较广泛应用价值。 第33页为了寻求一个通用植物条形码，许多学者进行了主动探索，已提出了各种条形码片段或组合方法，但至今仍没有达成明确共识。现有研究报道了在2种组合方案中选择片段方法，分别是Chase等()提出交通灯法(traf

19、fic light approach)和Newmaster等()提出等级(tier)分类法。第34页9月，在第二届国际生命条形码大会上，总结了5种片段组合：Chase等()提出rpoC1+rpoB+matK或rpoC1+matK+trnH-psbA；Kress和Erickson()提出rbcL+trnH-psbA，其能够对陆生植物进行识别和判定。韩国植物学家Ki-Joong Kim等提出matK+atpF-atpH+psbK-psbI或matK+atpF-atpH+trnHpsbA(Pennisi,) 第35页Steele等()用5个叶绿体DNA片段组合，对葫芦科Psiguria属6个种进行了

20、条形码判定，发觉每个物种均拥有各自独特条形码。11月7日至13日在墨西哥召开第三届DNA条形码国际学术大会上，与会者达成共识，一致提议在rbcL和matK之外，选择进化速率较快ITS和trnH-psbA，探讨它们在陆地植物中通用性、分辨率和适合程度。第36页植物基因组进化与动物基因组完全不一样。动物存在生殖隔离，不一样物种动物无法繁殖杂交后代，能够此为标准判定动物物种，但许多植物物种间能够相互杂交，这就含糊了它们之间遗传边界(genetic boundary)，造成了植物在种水平上有较大差异。所以在寻求整个植物界通用条形码过程中，可首先找出适合于大部分植物片段或组合，其它少部分则作为特例，再针

21、对不一样科属选择不一样条形码。编码基因通常变异较小，尤其是叶绿体基因组相对比较保守，使用编码基因和非编码基因组合，可能会更加好地识别和判定物种。多片段组合将是植物条形码选择最终方案。第37页第38页第39页第40页六、DNA条形码在药用植物判定中应用DNA条形码已经在动物中得到广泛应用，在植物中研究也正在快速开展，这将有利于非分类学专业工作者对相关材料进行快速、准确判定，尤其是对于药材判定。因为各片段(尤其是多片段组合选择)在不一样类群中应用效果不一样，当前还未取得一致植物条形码标准片段，所以，当前研究热点依然是选择和评价可能条形码片段，进行更大规模分析和整体评价。 第41页当前，DNA条形码

22、以其快速、准确和自动化，在生物物种判定领域研究方兴未艾，而在药材判定中应用尚处于萌芽状态。如能将DNA条形码用于市场品种混乱多起源药材判定，填补其在药材质量评价方面不足，形成能够全方面反应药材生物基原、质量、产地等信息DNA条形码系统，则能够快速准确判定多起源药材。该系统不但能够用于药材判定与质量评价，还能够探讨原植物间亲缘关系及系统发育。 第42页远景预期技术成熟后可形成供企业使用药材生产标准，在进货时以DNA条形码系统进行质量控制，在药材成品上标识DNA条形码，质检部门可对其进行验证判断真伪及是否符合生药质量标准。伴随DNA条形码技术飞速发展，能够预见地球上几乎全部生物种类都将具备唯一DN

23、A条形码。该技术有着巨大应用潜力，很快未来，手持式快速物种判定设备投入使用将给药材快速判定工作带来巨大便利。第43页谢谢第44页植物DNA条形码技术应用范围1.物种判定以及新种和隐种发觉除了能够进行物种判定外，利用DNA条形码技术还能够发觉许多新种和隐种。比如，Lahaye等单独使用matK片段对分布在中美洲l000各种兰科植物进行分析，显示单独使用matK片段能够揭示隐种而且证实了DNA条形码可行性；，Newmaster等经过DNA条形码技术发觉了感应草属(Biophytum DC)中3个隐种，并发觉了草沙蚕属(Tripogon Roemet Schuh)1个新种。帮助传统分类方法发觉那些形

24、态相同但存在遗传分化隐种是DNA条形码技术对分类学研究主要贡献，可显著提升实地生态学考查研究准确性和效率。第45页2.用于处理一些生物学问题JuradoRivera等旧副认为：DNA条形码还可用于处理一些复杂牛物学问题，如寄生关系等。经过扩增草食性动物牛trnL基因，发觉Peltoschema与4种寄生植物关系亲密。所以，利用DNA条形码能够正确识别寄生植物并确定营养关系。第46页3.在民族植物学研究中应用值得一提是，DNA条形码技术在民族植物学研究中也得到了一定应用。民族植物学以传统社会管理和利用植物为主要研究对象，在研究过程中经常经过借助民间分类学家(parataxonomist)知识来取

25、得当地人对植物进行分门别类信息。这些民间分类学家知识有些是传承自长辈、有些则结合了自己观察和实践，他们无须像分类学家那样普通需要取得植物繁殖器官才能有效判定物种，而是基于他们长久积累知识、经过植物某个生长阶段某个(些)器官(通常是营养器官)，就能准确说出植物当地名称、生长习性、资源和分布情况、用途和使用方法等第47页在开展民族植物学研究过程中，由植物分类学家和民间分类学家分别取得植物种数往往存在一定差异，或前者数量多于后者，或后者数量多于前者。到底哪一个物种数是准确?在没有足够时间等候植物开花和结果情况下，采集植物叶片经过DNA条形码技术进行分类签定，是一个理想快速判别方法。第48页基于这么构

26、想，加拿大圭尔夫大学Newmaster博士及其合作者，将DNA条形码技术应用于民族植物学研究。印度南部西高止山脉2个山地部落Irulas和Malasars把在当地被称为“Sunai pul”1种草沙蚕属禾草用于祭奠和其它经济用途，这种植物对当地小区居民十分主要，因而当地民间分类学家(或信息提供者informant)能轻易识别这一物种。有趣是，这是1个植物分类学上隐种，植物分类学家难以经过形态特征朱识别。Newmaster等采取DNA条形码技术，不但证实了民问分类学家鉴定该物种正确性，而且发觉Sunai pul是植物学上1个新种，将其命名为Tripogon cope Newmaster。所以，他们认