多环芳烃降解菌的分离、鉴定及驯化研究

1、 多环芳烃降解菌的分离、鉴定及驯化研究 李荣峰+赵碧川+陈丽君+王爱芳摘 要：该研究从百色大王岭原始森林生态环境的土壤和水中采样，进行了多环芳烃降解菌的分离、鉴定及驯化分析。结果表明，试验分离筛选出了能够降解多环芳烃萘的A、B 2种微生物菌种，其中，菌种A菌落形态为光滑，乳白色，边缘整齐，呈乳状微粘性菌落，显微镜下观察为杆状；菌种B菌落形态为发散毛状，白色，显微镜下观察为丝状。并对筛选出的A、B2个菌种进行了生理生化鉴定和优化驯化试验，最适生长代谢环境条件为：最适温度2528，最适转速120150r/min，最适多环芳烃萘的浓度为300320mL/L，最适pH值6.07.0，最适降解菌接种量1

2、015mL/100mL无机盐培养液，培养液体系中加入一定量的柠檬酸可提高降解速率。Key：多环芳烃；降解菌；分离；鉴定X132 A 1007-7731（2017）18-0013-04Isolation and Identification of PAHs Degrading BacteriaLi Rongfeng et al.（College of Agriculture and Food Engineering，Baise College，Baise 533000，China）Abstract：Isolation，identify and domestication about bacter

3、ia of degrading PAHs from the soil andwater sampling in Bise Dawangling virgin forest ecological environment had been studied.The results had separated A，B two microbial strains of degrading PAHsnaphthalene.And screened A，B two specieswere identified on physiological and biochemical and optimized on

4、 condition tests.The results showed that the optimum environmental conditions for growth and metabolism is the optimum temperature of 25 28 ，the optimum speed of 120 150 r/min，the optimum concentration on PAHs naphthalene of 300 320mL/L，optimum pH value of 6.0 to 7.0，the optimal degrading bacteria i

5、noculation of 10 15mL/100mL mineral medium.Broth system by adding a certain amount of citric acid can increase the rate of degradation of PAHs.Key words：PAHs；Bacteria of Degrading PAHs；Separation；Identify多環芳烃（Polycyclic aromatic hydrocarbons，简称PAHs）是一类广泛分布于海洋环境中的含有2个或2个以上苯环，以线状、角状或簇状排列的稠环型有机污染化合物1。随

6、着苯环数量的增加，其在环境中存在的时间越长，遗传毒性越高，现已成为全球重要的污染物之一，也是美国环保局制定的129种优先污染物中的一类2。环境中的PAHs存在于各种土壤、污水中，是一类难于降解的有机污染物，在适宜的情况下可能迁移到其他环境介质中，扩大污染源。随着现代化工业的发展，工厂废水排放系统的不完善，大量的烃类物质涌入江河湖海，严重威胁自然界的动植物以及人类的健康。如何治理及修复多环芳烃对环境造成的污染，已成为世界各国环境科学家研究的热点。现今，治理多环芳烃污染主要有物理、化学和生物几种方法，而普通的物理和化学修复污染存在各种问题，操作不当还会造成二次污染，而利用生物技术方法不仅可以消除烃

7、类污染、净化环境，而且投资少，耗能小，具有广泛的经济价值，对人类社会来说也是利大于弊。目前，生物修复中土壤PAHs污染物生物治理的相关研究有较多报道35。土壤中有多种微生物可以利用PAHs作为碳源和能源或利用其他的物质作为共代谢底物进行多环芳烃的降解、矿化6。因此，筛选分离降解多环芳烃的优势菌种对于开展多环芳烃污染生态系统修复方面的研究工作具有非常重要的现实意义。广西百色市自然保护区大王岭原始森林近年来作为主要以漂流著称的重要旅游胜地，每年都有大量的游客前往，而森林中存在一定的污染物质，特别是多环芳烃物污染逐渐严重，因此，研究原始森林中多环芳烃有机污染物的微生物降解显得尤为重要。本文针对大王岭

8、原始森林的水质和土质进行微生物检测，筛选出能够降解多环芳烃萘的菌类，并对其进行微生物形态学观察和生理生化鉴定，能了解森林存在的降解菌类型和分布情况，以期为多环芳烃污染的生物修复和治理提供有力支持。1 材料与方法1.1 试验材料1.1.1 样品采集 从百色大王岭原始森林的土壤（未受污染区、受污染区的样品）、水体（未受污染区、受污染区的样品），分别采集到样品4份，编号，冰箱保存待用。1.1.2 培养基配制 （1）无机盐培养基：（NH4）2SO4 1g，K2HPO4 2g，MgSO47H2O 0.5g，NaCl 0.1g，FeCl3 0.5g，CaCl2 0.5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL。（

9、2）萘-无机盐培养基：萘丙酮浓度分别为200，250，280，300，320，350mL/L萘丙酮，液体培养基富集菌种时每200mL无机盐培养基液加入10mL萘丙酮溶液，固体筛选培养基则在使用之前于固体培养基上滴萘丙酮溶液。 1.1.3 主要仪器和试剂 （1）主要仪器：全温振荡器（JBQ-2D，常州普天仪器制造有限公司），人工气候培养箱（LRH-300-GST，广州滬瑞明仪器有限公司），超净工作台（SW-CJ-2FD，苏净集团安泰公司），高压蒸汽灭菌锅（YXQ-LS-50S11，上海博迅实业有限公司），电子分析天平（FA2004，上海舜宇恒平科技仪器有限公司），数字式精密pH计（PHS-3C，

10、上海精密科学仪器有限公司），双目生物显微镜（B204LEDR，上海比目仪器有限公司），冷冻高速离心机（TGL-16M，湖南湘仪）。（2）主要药品：萘，丙酮，葡萄糖，菲，柠檬酸，邻苯二甲酸，联苯，醋酸钠，-萘酚，醋酸铅，二氯乙烷，无水硫酸钠，十二烷基苯磺酸钠，十二烷基硫酸钠。所有药品均为AR，分析纯。1.2 试验方法1.2.1 多环芳烃降解菌的富集培养 分离降解多环芳烃微生物采用单层平板划线分离法7。在无菌操作条件下，将采集到的10g土样和10mL水样分别加入200mL萘-无机盐培养液中（土样中加数粒玻璃珠将大块颗粒打碎），150r/min条件下震荡培养，7d后按体积比10%的接种量接种到新的培

11、养基中，反复继代培养5次，以富集微生物生长菌。1.2.2 多环芳烃降解菌的分离筛选 利用萘为唯一碳源的无机盐培养基进行微生物培养，使能利用萘的微生物存活下来，而其他微生物死亡的原理，从样品中分离筛选出多环芳烃降解菌。将富集培养后的培养液用稀释涂布法在萘-无机盐固体培养基平板上进行分离，并进一步反复划线分离在此培养基上生长出来的菌种。对能在萘-无机盐培养基上生长的微生物菌种进行形态学观察，包括菌落、菌苔、生活习性、生长速度、对环境的适应能力等，筛选出长势较好的微生物菌种，此菌种即为多环芳烃降解菌。1.2.3 多环芳烃降解菌的生理生化鉴定 对分离筛选出的菌种进行生理生化实验鉴定。鉴定方法包括革兰氏

12、染色、芽孢染色、荚膜染色、甲基红试验、乙酞甲基醇试验、葡萄糖发酵试验、过氧化氢酶试验和柠檬酸盐试验等。1.2.4 多环芳烃降解条件的优化驯化1.2.4.1 温度对多环芳烃降解的影响 温度是影响微生物生长代谢的重要因素，不同的温度使微生物产生不同的生理生化反应。分别移取10mL筛选出的2个菌种菌悬液至萘无机盐固体平板上，进行涂布无菌接种，置于分别设置为20、25、28、30、35和406组培养温度的培养箱中培养，除温度外其他培养条件相同，每组温度每种菌种接种3个培养皿，经培养7d后，观察所有培养皿中接种菌种的生长情况。1.2.4.2 转速对多环芳烃降解的影响 实验中多环芳烃降解体系为液相，在降解

13、过程中振荡培养能加速降解菌对多环芳烃的降解过程，不同的转速下降解效果不同 8。分别移取10mL筛选出的2个菌种菌悬液至装有100mL萘无机盐液体培养基的250mL三角瓶中，置于分别设置转速为60、90、120、150、180、210r/min的摇床上进行振荡培养，除转速外其他培养条件相同，培养7d后划线接种于萘无机盐固体平板上，培养5d，观察降解菌的生长状况。1.2.4.3 多环芳烃浓度对降解的影响 多环芳烃萘作为降解物，为降解菌提供碳源，其浓度的大小对降解菌的生长代谢有着很大的影响。设置萘丙酮的浓度分别为200、250、280、300、320、350mL/L，分别移取10mL筛选出的2个菌种

14、菌悬液至装有100mL不同浓度萘无机盐液体培养基的250mL三角瓶中，摇床振荡培养7d后划线接种于萘无机盐培养基固体平板上，28培养5d，观察降解菌的生长情况。1.2.4.4 pH值对多环芳烃降解的影响 设置萘无机盐培养液的pH值分别为5.0，6.0，7.0，7.5，8.0，9.0其6组梯度，分别移取10mL筛选出的2个菌种菌悬液至装有100mL不同pH值萘无机盐液体培养基的250mL三角瓶中，摇床振荡培养7d后划线接种于萘无机盐培养基固体平板上，28培养5d，观察降解菌的生长情况。1.2.4.5 降解菌接种量对多环芳烃降解的影响 接种量的多少也会影响到整个降解体系的降解效率。移取接种量分别为

15、5mL、10mL、15mL、20mL、25mL、30mL筛选出的2个菌种菌悬液至装有100mL相同萘无机盐液体培养基的250mL三角瓶中，摇床振荡培养7d后划线接种于萘无机盐培养基固体平板上，28培养5d，观察降解菌的生长情况。1.2.4.6 多环芳烃与有机物的共代谢 分别将浓度为5g/L的葡萄糖、柠檬酸、蔗糖、酵母膏、醋酸钠20mL加入100mL萘无机盐培养液中，分别移取10mL筛选出的2个菌种菌悬液至装有100mL加有不同有机物的萘无机盐培养液的250mL三角瓶中，摇床振荡培养7d后划线接种于萘无机盐培养基固体平板上，28培养5d，观察降解菌的生长情况。2 结果与分析2.1 多环芳烃降解菌

16、的分离和筛选 通过对生活习性、生长速度、环境的适应能力等形态学方面观察，最终筛选得到2种多环芳烃降解菌种。2种菌种如图1所示，其中一种为丝状，命名为菌种A，另一种为杆状，命名为菌种B。从图1可以看出，A菌菌落形态为光滑，乳白色，边缘整齐，呈乳状微粘性菌落，显微镜下观察为杆状；B菌菌落形态为发散毛状，白色，显微镜下观察为丝状。另外，实验中为保持降解菌的降解萘的特性，平板培养均采用萘-无机盐固体培养基培养，在此过程中，A菌种的长势保持不变，生长良好，而B菌种在接种了多次之后出现死亡现象，不能在萘-无机盐培养基上长久存活，由此可判断，A菌属于较强的多环芳烃降解菌，出现这种实验现象的原因可能与其生存的

17、环境中多环芳烃的浓度较大有关，而B菌种可能是新变种，降解多环芳烃的能力还未成熟，需要有机碳源提供营养，才足以存活。由此可见，A菌株更适合作为环境污染治理的研究材料，其稳定的降解多环芳烃的特性具有很大的潜在价值。 图1 菌落形态特征2.2 多环芳烃降解菌的生理生化鉴定 对微生物进行生理生化鉴定是认识了解微生物的途径之一，能更多的了解其特性，也是各种研究的参考依据之一。试验分别对分离筛选到的A、B2个多环芳烃降解菌种进行了生理生化鉴定实验，其鉴定结果见表2。从表2可看出，A、B 2个菌种进行革兰氏染色后，染色结果均为阳性，进行芽孢染色、荚膜染色及葡萄糖发酵试验，染色及试验结果2个菌种均为阴性，而甲

18、基红试验、乙酞甲基醇试验、过氧化氢酶试验以及柠檬酸盐试验，A、B2个菌种表现出不同的试验结果，在甲基红试验、乙酞甲基醇试验以及柠檬酸盐试验中，菌种A表现为试验结果阳性，菌种B表现为试验结果阴性；在过氧化氢酶试验中菌种B表现为试验结果阳性，菌种A表现为试验结果阴性。这些结果说明A、B2个菌种都不能生长于葡萄糖蛋白胨水溶液中，不能分解葡萄糖产生丙酮酸，即不能利用葡萄糖作为碳源。而菌种B能分解过氧化氢产生气体，菌种A能利用柠檬酸盐作为营养碳源，能在此培养基中很好的生长。表1 生理生化鉴定结果實验结果 A菌种 B菌种 革兰氏染色 + + 芽孢染色 - - 荚膜染色 - - 甲基红试验 + - 乙酞甲基

19、醇试验 + - 葡萄糖发酵试验 - - 过氧化氢酶试验 - + 柠檬酸盐试验 + - 注：表中“+”表示结果90%属于阳性，“-”表示结果90%属于阴性。2.3 多环芳烃降解条件的优化驯化 为了加深对多环芳烃降解菌的降解能力的了解，实验从温度、转速、多环芳烃萘的浓度、pH值、菌种接种量、多环芳烃与有机质的共代谢6个方面分别对萘降解菌进行优化条件实验。结果发现25和28条件下降解菌的长势最好，15，30，34，39温度下长势较差；在转速为120150r/min的条件下生长状况最好，其他转速下的生长状况一般。300320mL/L的萘浓度下降解菌的长势最好，其余浓度下的长势较差；接种量为10mL和1

20、5mL的实验组降解菌的长势较好，其他实验组长势较差。而在多环芳烃与有机质的共代谢中，加入柠檬酸的实验组长势最好，其中加入葡萄糖的实验组中出现了杂菌污染，其他实验组长势一般。3 讨论与结论多环芳烃降解菌作为微生物治理的研究对象之一，有待深入的问题还有很多，比如生物表面活性剂产生的机理及其在实际处理中的应用9，研究分子水平上降解菌的降解机制，与其他生物的共代谢降解机制，如何应用于实际等。针对百色大王岭原始森林而言，地方特色治理是环境治理的途径之一，如何结合本地生态特征与微生物治理相结合形成治理方案，是最需要深入探讨研究的问题。Geiselbrecht研究表明，许多细菌和真菌都具有降解多环芳烃的能力

21、，一般来说，被污染的环境中多环芳烃降解菌的数量比未污染环境中多，且降解多环芳烃的能力也远远高于未受污染区域10。在本试验样品的采集中，针对原始森林生态特点，分别采集了污染较小和污染较严重的两种土壤，以及污染较小和污染较大的2种水样，对4种样品进行降解菌的筛选分离，结果发现，4种样品中均出现降解菌，说明四个环境中均或多或少的受到了多环芳烃有机污染物的污染，这与Geiselbrecht研究结果相一致。其次，在分离之前，对降解菌的富集驯化培养可提高分离的成功率11，在富集的过程中，由于富集培养基中的碳源物质只有萘，故导致培养过程中不能利用萘的微生物死亡，能利用萘的微生物存活下来，并经过多次富集使其数

22、量增多，降解萘的能力提高，实验中采用不同培养液用量震荡培养的方法，用比较法筛选分离出长势最佳的菌种。本实验表明多环芳烃降解菌能够在萘-无机盐培养基中生存并降解萘，说明分离到的A、B2类菌种对环境的修复具有很高的潜在价值，将为多环芳烃污染的生物修复和治理提供有力支持。另外，对萘降解菌进行条件优化驯化实验可以深入把握降解菌的降解性能12，本实验根据筛选出的不同菌种分别对4种环境下的降解条件进行了分类研究，分别从温度、转速、多环芳烃萘的浓度、pH值、降解菌的接种量、多环芳烃与有机质的共代谢等6个方面进行了条件优化筛选，从各条件下筛选出长势最好的降解菌，则该条件即为最适生长条件。综合以上所有优化实验，

23、从百色大王岭原始森林自然保护区中分离筛选出的的多环芳烃萘降解菌经过条件优化培养后，得出最适生长代谢环境条件参数，综合为：最适温度范围为2528，最适转速范围为120150r/min，最适多环芳烃萘的浓度为300320mL/L，最适pH值范围为6.07.0，最适降解菌接种量为1015mL/100mL萘无机盐培养液。周乐等13在驯化培养基中添加另外一种氮源和碳源酵母膏，以增加降解菌的数量和降解效果。Grosser等14在含芘无机盐培养基中添加微量的酵母膏、蛋白胨和可溶性淀粉来驯化培养和保存多环芳烃降解菌。本实验中主要对葡萄糖、柠檬酸、蔗糖、酵母膏、醋酸钠这几种有机物进行多环芳烃共代谢研究，结果表明

24、体系中加入一定量的柠檬酸可以使降解菌A的降解速率提高。Reference1周明耀.环境有机污染与致癌物质M.成都：四川大学出版社，1990：62-103.2MCVEETY B D，HITES R A.The distribution and accumulation ofPAHs inenvironment J.Atomspheric Environment，1988，22（1）：511-536.3丁克强，骆永明.多环芳烃污染土壤的生物修复J.土壤，2001，33（4）：169-178.4HWANGS，CUTRIGHT T J.Biodegradability of aged pyrene and phenanthrene in a natural soil J.Chemosphere，2002，47 （9）：891-899. 5CHANG B V，SHIUNG L C，YUAN S Y.Anaerobic biodegredation of polycyclic aromatic hydrocarbon in soil J.