动物基因组DNA总RNA测定精

1、动物基因组DNA总RNA测定精目的要求 学习和掌握从动物组织中提取核酸的原理和操作技术；理解提取DNA/RNA的几种方法，原理和优缺点；学习测定DNA/RNA含量的根本原理及详细方法。理论根底核酸是遗传信息的携带者，是生命的最根本物质，它和蛋白质是构成生物体的主要成分；按化学组成可以将核酸分成两大类： 含脱氧核糖核酸DNA，主要存在于细胞核中； 含核糖核酸RNA，主要存在于细胞质内； 在生物体中核酸以结合成核蛋白的形式存在，但核酸极不稳定，在较剧烈的物理、化学因素和酶的作用下都很易降解。核酸别离、纯化原那么 保持核酸分子一级构造的完好性 意义：遗传信息全部储存在一级构造之中，核酸的一级构造还决

2、定其高级构造的形式以及和其他生物大分子结合的方式。 排除蛋白质、脂类、糖类等其他分子的污染 ； 无杂核酸分子的污染如纯化DNA分子时应 去除RNA分子。注意：在低温下进展操作；减少物理因素对核酸的机械剪切力；防止过酸、过碱引起核酸降解，控制pH值范围pH值5-9，并要保持一定离子强度；防止核酸的生物降解； 细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级构造。因此，所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。 进展核酸别离时最好新颖生物组织或细胞样品，假设不能马上进展提取，应将材料贮存于液氮中或-70冰箱中。1、RNA的提取与测定RNA广泛存在啤酒酵母，面包酵母

3、，酒精酵母和各种动物组织中。常见方法根据RNA的种类和来源： 苯酚法实验室最常用的方法 去污剂法、盐酸胍法，苯酚法：组织匀浆后用苯酚处理离心，RNA即溶于上层被苯酚饱 和的水相中， DNA和蛋白质那么留在苯酚层中，向水相加冷乙醇后， RNA即以白色絮状沉淀析出。优点：较好除去DNA和蛋白质，且获得生物活性的RNA。工业提取RNA的方法酵母细胞富含RNA，是工业上提取RNA的主要原料。工业上制备RNA多项选择用低本钱、适于大规模操作的浓盐法或稀碱法。这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备单核苷酸的原料，其工艺较简单。浓盐法：使用10氯化钠的溶液，同时在90摄氏度热提取3-4小时，以

4、改变细胞壁的通透性，使核酸从细胞内释放出来。经冷却，离心后上清液由乙醇沉淀RNA。稀碱法：使用0.2氢氧化钠裂解酵母，然后用酸中和，除去蛋白和菌体，上清液由乙醇沉淀RNA，或调等电点PI 2.5 沉淀。工业提取RNA的方法原理：动物和植物组织的脱氧核糖核蛋白DNP可溶于水或浓盐溶液如1mol/L氯化钠，但在盐溶液中溶解度最低，而核酸核蛋白RNP最大，利用这一性质可将其分开。方法：RNP 提取出来，最后用酚将RNA和蛋白质分开。本实验提取RNA的原理及方法RNA 提取匀浆：称取3克牛肝剪碎，加20mL 0.14mol/L氯化钠溶液10000r/min左右匀浆1分钟左右；离心：匀浆后溶液离心800

5、0 r/min离心7分钟，量取上清液毫升数，沉淀物留做提取DNA；除杂质：于上清液中参加等体积80苯酚溶液，搅拌充分混合10-15分钟，置冰箱冷却静止10-15分钟，离心取含有RNA上层水相，弃下层酚相；沉淀RNA：取上层水相含RNA溶液，参加2倍体积95冷乙醇，搅拌，充分混合，置冰箱中冷却(约10-15分钟)，至出现白色絮状物RNA，离心8000 r/min离心7分钟，取沉淀物；溶解：用少量去离子水约20毫升溶解沉淀物，用以测定其含量。RNA含量测定方法测定RNA含量的方法：紫外吸收法、定磷法、地衣酚；本实验用地衣酚测定 原理：当RNA与浓盐酸共热时，即可发生降解，形成核糖继而转变成糠醛，后

6、者与3.5-二羟基甲苯地衣酚反响，在Fe3+或Cu2+催化下，生成鲜绿色复合物，反响在670nm处有最大吸收峰，RNA浓度在10 100g/mL范围内，光吸收与RNA浓度成正比。 将样品配制成含5 50g/mL核酸的溶液，于紫外分光光度计上测定260nm吸收值，计算核酸浓度： RNA浓度（g/mL）=式中：O.D260为260nm波长处吸收值；L为比色杯的厚度；0.024为每毫升溶液内含1微克RNA的光吸收值； 稀释倍数紫外吸收法 在酸性环境中，定磷试剂中的钼酸铵以钼酸形式与样品中的磷酸反响生成磷钼酸，当有复原剂存在时磷钼酸立即转变蓝色的复原产物钼蓝。 H3PO4+12H2MoO4H3P(Mo

7、3O10)4+12H2O 复原剂 钼 蓝 钼蓝最大的光吸收在650-660nm波长处。当使用抗坏血酸为复原剂时，测定的最适范围为1-10微克磷。定磷法RNA 含量测定 取8 支试管，6 支试管按上表所添加各种试剂绘制标准曲线。另2管各参加待测液，再加和 水和 地衣酚试剂试剂，加毕，摇匀，8 支试管统一沸水加热25 min，取出后冷水冷却，测定各管OD670 为纵坐标，RNA 浓度为横坐标作图，并计算提出的RNA 的量。(控制RNA 浓度在10 100g/mL 之内 管号试剂(mL) 123456RNA标准液(100gmL-1)00.61.21.82.43.0蒸馏水3.02.41.81.20.6

8、0地衣酚试剂3.03.03.03.03.03.0试剂和器材材料：牛肝试剂：标准RNA溶液：100g/mL地衣酚3,5-二羟基甲苯试剂 现用现配80苯酚溶液95乙醇器材：组织捣碎机、离心机、分光光度计、烧杯、量筒等考虑题RNA 提取方法有几种？有什么优缺点？RNA 提取过程中应注意什么？DNA的提取及含量测定在动植物中，小牛胸腺、动物肝脏、鱼类精子，植物种子的胚中都含有丰富的DNA；微生物中，面包酵母含4%，啤酒酵母含6%，大肠肝菌含9%10%。本实验：将沉淀物溶解于生理盐水，参加去污剂十二烷基硫酸钠SDS溶液，使DNA与蛋白质别分开。参加固体氯化钠使其浓度到达1mol/L，使DNA溶解。加氯仿

9、-异戊醇去除蛋白质，也可重复该步操作得较纯DNA。最后用95%乙醇沉淀DNA。去除蛋白的常用方法变性剂法：用SDS等去污剂使蛋白质变性，可以直接从生物材料中提取DNA；苯酚法：用含水的酚溶液沉淀蛋白质和DNA，分层、离心。因蛋白变性，抑制了核酸酶活性，并且操作过程比较缓和，可以得到较好的DNA制品；氯仿法：用含辛醇或异戊醇的氯仿振荡核蛋白，使乳化，离心除蛋白，DNA在上层水相，用乙醇沉淀上层，可将DNA沉淀出来。DNA的提取溶解：将离心后除去RNA的沉淀，用30ml生理盐水溶解，充分搅拌后，匀浆一次。加4毫升10SDS溶液，使溶液的SDS浓度到达1左右，边加边搅拌，放置60 水浴保温10分钟不

10、停搅拌，冷却。加固体氯化钠，使溶液氯化钠浓度到达1mol/L，充分搅拌10分钟；除杂质：加等体积氯仿-异戊醇混合液，充分震荡10分钟， 8000 r/min离心7分钟，取上层液量好体积，倒入烧杯中离心管，加同体积的氯仿-异戊醇混合液，重复上次操作。直至界面不出现蛋白凝胶为止；沉淀：准确量取上清液体积，加2倍体积95冷乙醇，搅拌后，置冰箱静止冷却，待有白色丝状物出现，约10-15分钟，离心8000 r/min离心7分钟，得白色沉淀；溶解：10毫升溶解。DNA含量测定方法二苯胺法： DNA分子中的2-脱氧核糖在酸性环境中变成-羟基-酮基戊醛，与二苯胺试剂作用生成蓝色化合物max=595nm。DNA

11、在40 400微克范围内，光吸收值与DNA的浓度成正比。在反响液中参加少量乙醛可进步灵敏度，而且其他化合物的干扰也显著降低。 除DNA外，脱氧木糖，阿拉伯糖也有同样反响，其它多数糖类，包括核糖在内，一般无此反响。而蛋白质、多种糖及其芳香衍生物，羟基醛都能与二苯胺形成有色物质，干扰测定。DNA含量测定1、DNA标准曲线的制定 6支试管，依次参加0、0.4、0.8、1.0、1.2、1.6和2.0mL DNA标准溶液。添加蒸馏水，使之都成为2mL。然后各参加4mL 二苯胺试剂，混匀。于60恒温水浴中保温1h，冷却后于595nm处进展比色测定。以DNA浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。 2

12、、制品的测定 取2支试管，各加待测液，加水至2mL内含DNA应在标准曲线的可范围之内和4mL 二苯胺试剂，摇匀。其余操作同标准曲线的制作。 3、根据测得的光吸收值，从标准曲线待测上查出相应该光吸收值DNA的含量. 管号试剂(mL) 012345678DNA标准液(200gml-1)00.40.81.01.21.62.000蒸馏水2.01.61.21.00.80.401.81.2二苯胺试剂4.04.04.04.04.04.04.04.04.0DNA待测液00000000.20.8摇匀，60水浴保温1h，在595nm处测吸光度（OD值或A值）OD595DNA含量(g)080160200240320400试剂和器材试剂：生理盐水10SDS氯化钠95乙醇氯仿-异戊醇混合液二苯胺试剂现用现配器材：恒温水浴、分光光度计、移液管等考虑题二苯胺法测定DNA，为什么加乙醛，作用是什么？除杂质常用那些方法？工 艺 图3g肝脏 + 20mL0.14mol/L 氯化钠 匀浆, 1min 离心