解密-简答题pdf

1、【简答题】.苏云金芽胞杆菌的基因组大小为 5Xl06bp,若p=99% ,平均克隆片段为 100kb ,计算构建这样一个完全的基因文库所需的克隆数。.什么叫标记获救现象？.依赖于DNA的RNA聚合酶包括SP6噬菌体RNA聚合酶和T4或T7噬菌 体RNA聚合酶，这类聚合酶可用于表达外源基因，阐述常用的构建策略？.简述入噬菌体载体的克隆原理及一般步骤？.简述限制性内切核酸酶(Restriction endonuclease )的概念及其生物学功 能？.以下为某一 DNA序列，据此回答下列问题5 - GATCTAAATTCTAGCCTTGAACTCATACGGGATTGTTAAATCTA-3 - C

2、TAGATTTAAGATCGGAAC-T-T-G-AGTATGCCCTAAGAATTTAGATC5-(1)在DNA测序中，引物设计的基本原理是什么？(2)如果你打算扩增上图所示的一段序列之间的DNA ,你会如何选择引物？.什么是Gene library ?它与cDNA library 有何区别？.天然的质粒载体(plasmid vectors )通常需经改造后才能应用，包括去除 不必要的片段，引入多克隆位点等。试问在此过程中如何增减酶切位点？.何谓测序酶？与Klenow片段相比，它有何优点？.何谓RNA的斑点杂交和狭缝杂交？.单核甘酸置换插入或缺失中，引物设计的要求？.为什么野生型的人噬菌体D

3、NA不宜作为基因工程载体？.在对PCR产物进行电泳检测时，有时会出现拖带或非特异性扩增条带，请 分析其原因？如果检测结果是看不到 DNA带或DNA带很弱，那又是为什么？ 14.简述基因克隆的两个基本特征？.YAC载体具有什么样的功能性元件？为什么它在克隆大片段时具有很大的优越性？.某DNA序列中存在DpnI酶切位点，以此DNA为模板，在体外合成 DNA序 列，当用该酶进行酶切时，发现切割不动，试分析可能原因？.双脱氧终止法测定DNA序列的片段一般不能太长，如何运用本章所学知 识测定较长片段的DNA序列？.试简述 入 噬菌体的Lytic growth 和Lysogenic state两种循环的分

4、化及其调节过程？.简述随机引物标记的原理和步骤？.噬菌粒(PhagemicD具有那些特征？许多 phagemid都有一个主要的缺点, 即在辅助噬菌体感染后，有时候单链 DNA的产量较低且重复性一般较差，试分 析其原因？.谈谈你对gene的认识，并简要说说gene概念的发展情况？.抗性基因(Resistant gene )是目前使用的最广泛的选择标记，常用的抗生 素抗性有哪几种？并举两例说明其原理？.PCR引物设计引入酶切位点时，为什么需在酶切位点后加上一些碱基？.经典RACE克隆的原理是什么？有何意义？.简述差别杂交的原理和基本思路？.假如从一个原核生物中cloning 某基因(1 kb -2

5、kb ),请谈谈它的基本步骤？.简述T4多核甘酸激酶的活性和用途？.得到一段未知功能的基因序列，如何对它进行分析？.何为 a -complement ?如何利用 a -complement来筛选插入了外源 DNA 的重组质粒？.请简述F+,F-,Hfr,和F它们之间的关系和相互转化的过程？.何谓Star activity ?简述Star activity的影响因素及克服方法？您的答案：.如何从原核生物中克隆复制子？.通过双向蛋白质电泳发现某蛋白质与某植物的一种表型密切相关，若要利用 编码该蛋白质的基因来转基因植物，试问如何分离得到该基因？. BAP和CIAP有何作用？为何一般采用 CIAP而不

6、采用BAP ?.当向细菌培养基中加入氯霉素时，可以使细菌质粒的拷贝数得到扩增，试分析其原理？.什么是 Western blot ?它和 Southern blot 有何区别？.如何理解gene及其产物的共线性和非共线性？.大肠杆菌DNA聚合酶I ,具有3-5 外切活性和5-3 的聚合酶活性 以及5-3 的外切活性，试根据此推测该聚合酶可能具有哪些用途？.Cosmid的工作原理是什么？.小量制备质粒DNA ,用质粒中特定的酶切发现切割不动，试分析可能原因 及克服方法？.克隆cDNA常见的问题？.琼脂糖凝胶电泳中，简述影响 DNA在凝胶中迁移速率的因素？.什么是Gene library ?它与cD

7、NA library 有何区别？.转导(Transduction )可分为普遍性转导(generatized transduction )和 局限，性转导 (specialized transduction ), 试比较其异同？.在酶切缓冲液中，一般需加入BSA,请问加入BSA的作用是什么？并简述其原理？.分析比较琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳的异同点？.采用同聚物加尾的方法进行dscDNA克隆，一般采用 dC/dG而不采用dA/dT ,简述其原因？.在PCR反应的后期，或者循环次数过多时，反应体系中就会出现一种所谓 的平台效应(Plateau effect ),请 问什 么 叫 Plat

8、eau effect ?产生Plateau effect的原因有哪些？.利用细胞的中断杂交(intermit hybridization )可以进行基因定位，请说 出其原理？.如何使用Methylase 对克隆DNA进行保护？此步骤有什么意义？.为什么野生型的 人噬菌体DNA不宜作为基因工程载体？【简答题参考答案】. n=ln(1-p)/ln(1-f) n:一个完全基因文库所包含的重组体克隆数 p:所期望的目的基因在基因文库中出现的几率 f:插入片断的平均大小与基因组 DNA大 小的比值 根据以上公式可得到所需要的克隆数为 228. 70年代初 (|)X174 DNA ( ssDNA 5386

9、bp),当用带琥珀突变的 ssDNA与变 性的野生型DNA片段一起转染细菌时，观察到“标记获救”现象，即产生带野 生型基因组的噬菌体，原因是野生型 DNA片段与突变体的相应序列退火，形成 错配的异源双链体，后者可被宿主编码的错配修复系统转变为全长的野生型基 因组。由此可利用突变的 DNA片段将突变引入到野生型 DNA中。.将T7 RNA聚合酶基因置于 E.coli lacUV5启动子之下，插入到 入 噬菌体 中，感染 E.coli ,建立稳定的溶源菌。E.coli BL21 (DE3)菌株即为将lacUV5启动子和T7聚合酶基因置于 入 噬菌体DE3区，该 入噬菌体DNA整合于染色 体的BL2

10、1处。若将T7噬菌体启动子控制的目的基因经质粒载体导入该宿主菌 中，在IPTG诱导下，可启动外源基因的表达；先导入带T7噬菌体启动子控制的目的基因的质粒，再用入噬菌体(带T7 RNA聚合酶基因)感染E.coli ,激活目的基因的表达。.入噬菌体载体属于克隆载体，主要用于克隆 DNA片断。工作原理：入噬菌体载体克隆外源DNA片断的原理与质粒载体的工作原理是类似的，只是在形式上 有许多差别。载体和外源 DNA片断经过酶切后，外源 DNA片断插入到载体的适当 位置，或置换载体的填充片段。这种连接后的重组DNA保留增殖性能，但由于分子量太大，不能象重组质粒 DNA那样可通过转化方法进入大肠杆菌。通过提

11、取入噬菌体的蛋白质外壳，可在体外将重组噬菌体DNA进行包装，形成噬菌体颗粒。这样DNA注射到宿的噬菌体颗粒保留对大肠杆菌的感染能力，可将被包装的重组噬菌体主菌中。通过裂解生长，可增殖重组噬菌体。克隆步骤：通过裂解过程增殖载体；载体与外源 DNA的酶切；外源DNA与载体的 连接；重组噬菌体的体外包装；包装噬菌体颗粒的感染；筛选。.定义：指识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。生物学功能：保护宿主不受外来 DNA分子的感染，可降解外来的 DNA分子，从而阻止其复制和整合到细胞中.引物选择的原则：长度：至少 16bp ,通常为18-30bp ,更短的引物一般会降低扩增

12、的特异性，但会提高扩增的有效性；引物的解链温度：两个引物之间的Tm值差异最好在2-5 C。对于小于20个碱基的引物，其 Tm值可用简易公式计算，Tm = 4 ( G + C ) + 2 ( A + T ) 。对于14-70个核昔酸的引物可用以下公式计算。 Tm=81.5 + 16.6( 1gK+ ) + 0.41( G + C )% - ( 675 / N ) N表示引物的核昔酸数目，K+表示单价离子即钾离子的浓度；避免引物内部或引物之间存在互补序列(3个碱基)，从而减少引物二聚体的形成以及引物内部二级结构的形成。G + C 含量：尽量控制在40%60%之间，4种碱基的分布应尽可能均匀。尽量避

13、免喋吟或嗑哽的连续排列，以及 T在3末端的重复排列； 引物的3末端最好是G或C ,但不要GC连排。(2) 5-GATCTAAATTCTAGCCTTGAACT- 3 5-CTAGATTTAAGAATCCCGTATG-3.由大量的含有基因组 DNA (即某一生物的全部 DNA序列)的不同DNA片段 的克隆所构成的群体，称之为基因文库。一个完全的基因文库，应该能够保证从中筛选到目的基因。cDNA文库：若这些大量的重组 DNA分子所含的外源DNA不是基因组DNA ,而是由某一生物的特定器官或特定发育时期细胞内的 mRNA 经反转录形成的cDNA，他们所构成的重组 DNA克隆群体，则称之为cDNA基 因

14、文库.在酶切水平上，通过酶切和连接产生新的酶切位点。将产生的5突出端补平后，再连接以产生新的酶切位点；同尾末端的连接，不同的同尾酶切割DNA产生的末端，再相互连接时，可产生新的酶切位点，同时原来的酶切位点却消失；平末端的连接.测序酶是一种经过化学修饰的T7噬菌体DNA聚合酶。与Klenow 聚合酶相比，该酶的3-5外切活性完全缺失。测序酶持续合成能力很强，聚合速率很高，对诸如dITP和7-脱氮dGTP等用于提高分辨率使测序凝胶某些区段上的压缩条带得以分开的核甘酸具有广泛的耐受性。它是测定长段DNA序列的首选酶。.将DNA或RNA样品直接点在固体支持物上，然后与核酸探针进行分子杂交，这种方法称为

15、斑点杂交。如果借用一种模具，将核酸样品加到模具的狭缝中，通过真空抽滤，印迹到滤膜上，然后进行杂交称为狭缝杂交。11.5端完全配对，使得上游（引物）起始的DNA合成不容易将诱变寡核昔酸取代，约需810bp。3端所形成的杂交体足以引导 DNA合成。如果错配核昔酸 太靠近3端，3端将不能形成稳定的杂交体，易被外切活性降解。所以3端需有79bp完全配对。为便于筛选，应选用可形成稳定杂交体而长度最短 的诱变寡核甘酸。一般1719bp ,错配在中央，使得完全配对的杂交体与错 配杂交体之间的热稳定性差异足够大。.野生型噬菌体DNA没有容载能力，因为噬菌体的头部对 DNA包装的量是 有限制的，不能大于基因组的

16、105%,所以要将 入噬菌体改造成载体，必须削 减分子量；野生型的 人噬菌体对于一些常用的酶都有多个识别和切割位点， 不便于克隆；没有可供选择的标记；野生型的 人噬菌体具有感染性，因此 不够安全。. PCR扩增有时出现拖带或非特异性扩增条带。其原因往往由于酶量过多或酶 的质量差，模板中杂质过多，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多等引起。如果检测结果看不到DNA带或DNA带很弱可能是：模板中含有杂质；酶失活；引物质量不好； Mg2+浓度过低；反应体 积的改变等等；其他的一些物理原因，如复性温度低，变性时间短等或者也可 能是由于靶序列的变异等。.基因克隆的两个基本特征是

17、一是强调外源核酸分子（一般情况下都是DNA）在不同宿主中的繁殖，打破自然种的界限将来自于不相关物种的基因放入一个宿 主中是基因操作的一个重要特征，基因操作的另一个重要特征是繁殖。.YAC带有天然染色体所有的功能元件，包括一个着丝粒，一个复制起点，两 个端粒。YAC能够容纳长达几百kb的外源DNA，这是质粒和粘粒办不到的。 大片断的插入更有可能包含完整的基因，在染色体步移中每次允许更大的步移距 离，同时减少完整基因组文库所需的克隆数目。.生物体内的DNA序列可能是经过甲基化修饰的，而在体外合成时，缺乏这 种修饰作用。当用依赖于甲基化的限制酶DpnI来切割非甲基化的序列时，就会出现不能切割的情况。

18、.将所需要测序的DNA片断采用2种不同的限制性内切酶切割，产生不同的酶切片段，将此酶切片段连接到载体上，测序后，拼接，即可得到全长的DNA序列；用一种限制性内切酶进行部分酶切，酶切产物与载体连接后，测序，拼 接，即可得到全长DNA片断。采用以上任一方法均可，需要注意的是，在进行 部分酶切时，应该控制好条件，要确保所得到的酶切片断能覆盖所需测序的DNA片断。. Lytic growth 是入噬菌体在宿主中大量复制并组装成子代入噬菌体颗粒，导致宿主细胞裂解。Lysogenic state 为 人噬菌体基因组DNA通过位点 专一性重组整合到宿主染色体 DNA中随宿主的繁殖传到子代细胞。调节过程： 由

19、感染复数和细胞的营养状态决定的，感染复数越高，营养状态越差，则溶源化 的频率就越高。溶源现象的生化媒介可能是3-5 cAMP ,它在细胞内的浓度会随营养条件的变化而改变，当细胞在富营养培养基中生长时，cAMP的浓度较低，有利于裂解生长；在缺乏 cAMP的突变细胞中，更有利于裂解生长另外一个 重要的调节因素是噬菌体的CH蛋白，它是噬菌体基因转录的激活子，抑制裂解功能基因的表达，催化噬菌体 DNA整合到细菌的染色体中去。高浓度的CH蛋白促进溶源化，而低浓度的CH蛋白促进裂解生长。当 CH蛋白浓度足够时，激活CI蛋白和基因int的表达，导致噬菌体DNA与染色体整合，朝着溶 源态生长。.随机引物是人工

20、合成的长度为 6个核昔酸的寡聚核昔酸片段群体，含有各种 可能的排列顺序（46=4096）;或是用DNA酶处理小牛胸腺 DNA后获得的6 12个碱基的片段。将待标记的 DNA片段同随机引物一起进行杂交，并以杂交 体上的寡聚核甘酸为引物，在 Klenow酶的作用下合成互补DNA链，当反应底 物中有放射性底物dNTP时，新合成的DNA就带上了标记。.参考答案： 双链DNA既稳定，又高产，具有常规质粒的特征；免却了 将外源DNA片断从质粒亚克隆于噬菌体载体；由于载体足够小，故可得到长 达10kb的外源DNA区段的单链。原因：噬菌体携带的基因间隔区的确切序 列，携带完整基因间隔区的质粒可由于干扰辅助病毒

21、DNA复制而抑制子代噬菌体颗粒的产生；基因间隔区插入质粒的具体位置，基因间隔区插入 pBR322Hindm位点所构成的噬菌粒，会严重干扰野生型噬菌体的生长，而将基因间隔 区插入Ahearn位点则不然；辅助噬菌体的性质，野生型丝状噬菌体及其抗干扰突变株都被用作辅助噬菌体。辅助噬菌体基因间隔区插入了lacZ序列，因而基因n产物对它的识别不那么有效；克隆于噬菌粒的外源DNA的大小与性质，因外源DNA片断的大小而异，单链 DNA的产量可以在510倍之间有所 差异（一般来说，外源DNA越大，产量越低）。另外，由于一些尚不清楚的原 因，大小相同的外源DNA ,其单链DNA的产量也参差不齐。.能够表达和产生

22、基因产物（Proteinor RNA ）的DNA序列（可自由发挥，发展 情况请查找相关资料）基因概念的发展：基因作为遗传学中的专用术语，其概念每 发展一步都意味着遗传学乃至整个生物学的一次革命和突破，其内容的每次丰富和 充实都凝聚着生物学家们的滴滴心血。“基因”概念的提出：遗传学的奠基人孟德 尔在1866年发表的论文植物杂交试验指出生物每一个性状都是通过遗传因子 来传递的，遗传因子是一些独立的遗传单位。这样把可观察的遗传性状和控制它的 内在的遗传因子区分开来了，遗传因子作为基因的雏形名词诞生了。1909年丹麦遗传学家约翰逊在精密遗传学原理一书中提出“基因”概念，以此来替代孟德尔假定的“遗传因子

23、”。从此，能够表达和产生基因产物（protein or RNA ）的DNA序列（可自由发挥）“基因” 一词一直伴随着遗传学发展至今。基因结构和功能的探索：摩尔根和他的学生们利用果蝇作了大量的潜心 研究，1926年他的巨著基因论出版，从而建立了著名的基因学说，首次完成 了当时最新的基因概念的描述，即基因以直线形式排列，它决定着一个特定的性 状，而且能发生突变并随着染色体同源节段的互换而交换，它不仅是决定性状的功 能单位，而且是一个突变单位和交换单位。1941年比德尔和塔特姆提出一个基因一个酶说；1949年鲍林与合作者在研究镰刀型细胞贫血症时推论基因决定着多肽 链的氨基酸顺序；1944年艾弗里、麦

24、卡蒂首次用实验明确证实：DNA是遗传信息的载体；1952年赫尔希和蔡斯进一步证明遗传物质是 DNA而 不是蛋白质；1953年美国分子生物学家沃森和英国分子生物学家克里克通力协 作，根据X射线衍射分析，提出了著名的 DNA双螺旋结构模型，进一步说明基因 成分就是DNA ,它控制着蛋白质的合成；1957年法国遗传学家本滋尔以 T4噬菌体作为研究材料分析了基因内部的精细结构，提出了顺反子学说。这个学说打 破了过去关于基因是突变、重组、决定遗传性状的“三位一体”概念及基因是最小的不可分割的遗传单位的观点，从而认为基因为DNA分子上一段核昔酸序列，负责着遗传信息的传递，一个基因内部仍可划分为若干个起作用

25、的小单位，即 可区分成顺反子、突变子和重组子。一个作用子通常决定一种多肽链合成，一个基 因包含一个或几个作用子。突变子指基因内突变的最小单位，而重组子为最小的重 组合单位，只包含一对核昔酸。所有这些均是基因概念的伟大突破。关于基因的本质确定后，人们又把研究视线转移到基因传递遗传信息的过程上。1961年开始，尼伦伯格和科拉纳等人逐步搞清了基因以核昔酸三联为一组编码氨基酸，并在1967年破译了全部64个遗传密码，这样把核酸密码和蛋白质合成联系起来。然后，沃森和克里克等人提出的“中心法则”更加明确地揭示了生命活动的基本过程。1970年特明以在劳斯肉瘤病毒内发现逆转录酶这一成就进步发展和完善 了 “中

26、心法则”，至此，遗传信息传递的过程已较清晰地展示在人们的眼前。过去 人们对基因的功能理解是单一的即作为蛋白质合成的模板。1961年法国雅各布和莫诺的研究成果，又大大扩大了人们关于基因功能的视野。他们在 研究大肠杆菌乳糖代谢的调节机制中发现了有些基因不起合成蛋白质模板作用， 只起调节或操纵作用，提出了操纵子学说。从此根据基因功能把基因分为结构基因、调节基因和操纵基因。基因概念的进一步发展：70年代后，基因的概念随着多学科渗透和实验手段日新月异又有突飞猛进的发展，主要有以下几个方面。基因具重叠性、内含子和外显子、管家基因与奢侈基因和基因的游动性。所有这 些成果无疑给基因概念中注入鲜活科学的内容，帮

27、助人们揭开层层面纱去更加全 面了解基因的真面目。时代在发展，科学在进步，基因概念的深入发展，必将对 人类的文明进步产生强大的推动作用。.氨芳青霉素抗性基因( ampr)、四环素抗性基因( tetr )、氯霉素抗性基因 (Cmr)、卡那霉素和新霉素抗性基因( kanr , neor )以及琥珀突变抑制基因 supF 5% ;酶过量(100U/ml);低离子强度(8.0);有机溶剂如PMSD (二甲基亚碉)、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺( dimethylacetamide )、二甲基甲 酰胺(dimethylformamide )和 sulphalane 等；用其它二价阳离子 Mn2+、Cu2+、

28、 Cc2+ 或 Zn2+ 代替 Mg2+。星星活性的抑制措施：减少酶的用量，避免过量酶切，减少甘油浓度；保证反应体系中无有机溶剂或乙醇；提高离子强度到100150mM （在不抑制酶活性的前提下）；降低反应pH至7.0 ;使用Mg2+作为二价阳离子。.载体的抽提（该载体无复制子或复制子被切除）及酶切；将所需要研究的外源DNA进行不完全消化；将经过不完全消化的外源 DNA片断连接到载体的多克隆位点；在抗性平板上能生长的质粒即为含有复制子的目标片段，可 用此方法进一步将复制子定位。.首先，将特异性蛋白进行转膜，然后进行氨基末端测序，依据测序结果设计 探针从该植物的cDNA文库中筛选阳性克隆（如果没有

29、 cDNA文库可以先做 cDNA文库）；最后进行亚克隆，将目标片段转入表达载体上进行表达分析。. 作用：催化除去DNA或RNA 5磷酸。BAP抗性强，抗高温和去污剂。CIAP可用蛋白酶K消化灭活，或在5mM EDTA下，65C处理或75 C处理10分钟， 然后用酚氯仿抽提，纯化去磷酸化的 DNA ,从而去除CIAP的活性。相比之下， CIAP比BAP更易去除，因此，一般采用 CIAP。. pMB1质粒的复制并不需要质粒编码的功能蛋白，而是完全依靠宿主提供的半衰 期较长的酶（DNA聚合酶I , DNA聚合酶田），依赖于 DNA的RNA聚合酶，以及 宿主基因dnaB、dnaC、dnaD和danZ的

30、产物。因此，即使存在抑制蛋白质合成 并阻断细菌染色体复制的氯霉素或壮观霉素等抗生素时，带有pMB1 （或ColE1）复制子的质粒将继续复制，最后每个细胞中可积聚23千个质粒。. Western blot是将蛋白质经电泳分离后从凝胶中转移到固相支持物上，然后利用特异性抗体进行检测。它与 Southern blot的不同在于探针的性质不同，在 Western blot中所使用的探针是抗体（蛋白质），而 Southern blot的探针则是核酸。.基因决定蛋白质的序列组成，是由密码子对应特定氨基酸所决定的。当一个 基因的核甘酸序列与其产物的氨基酸序列是一一对应时，则表明它们是共线性 的。在原核生物中

31、，基因及其产物是共线性的。20世纪70年代以来，在真核生物中，发现了间断基因，后来发现这种间断基因在真核生物中普遍存在， 也就是后来所说的基因间存在着内含子。内含子指真核生物基因中不能被翻译 成蛋白质的DNA片断，但可被转录，当两侧序列的转录RNA被剪接在一起时，就将内含子转录的RNA从整个转录物中除去。外显子是指能够翻译成蛋白 质的任一间断的基因片段，一个基因可有多个外显子。内含子并不是一成不变 的，具有相对性，对一个 DNA片断来说，在某个基因中是内含子，但在另一个 基因中却可以作为外显子。.利用E.coli DNA 聚合酶 的5-3外切核酸酶活性，可用切口平移法标记DNA ,所有DNA聚

32、合酶中只有此酶有此反应；用于 cDNA克隆中的第 二链，即单纯的DNA聚合活性；对3突出端的DNA作末端标记（交换或 置换反应）。.粘粒载体的主要原理类似入噬菌体载体。在外源片断与载体连接时，粘粒载体相当于 入噬菌体载体的左右臂，cos位点通过粘端退火后，再与外源片断相间连接成多联体。当多联体与入噬菌体包装蛋白混合时，入噬菌体A基因蛋白的terminase 功能将切割两个cos位点，并将两个同方向 cos位点之 间的片断包装到 入噬菌体颗粒中去。这些噬菌体颗粒感染大肠杆菌时，线状的 重组DNA就象 入噬菌体DNA 一样，被注入细胞并通过 cos位点环化。这样 形成的环化分子含有完整的粘粒载体，

33、可象质粒一样复制并使其宿主获得抗药 性。因而，带有重组粘粒的细菌可用含适当抗生素的培养基挑选。通过这种方 式，就将外源DNA片断通过粘粒载体克隆到大肠杆菌中去了。.加solution I前，没有用STE洗涤，导致细菌菌株的细胞壁成分抑制 限制酶的活性；没有用酚：氯仿抽提蛋白，导致DNA能耐受限制酶酶切；限制酶对甲基化敏感，而所采用的宿主为非甲基化缺陷型，可采用对甲基化不 敏感的同裂酶，或换用甲基化缺陷型的宿主菌株。.cDNA第一链太短或产量太低，尽管这些问题可能出自用于cDNA第一链合成的任一组分，但在更多情况下，它们反映出用作模板的mRNA的低劣质量；文库中cDNA插入片段的长度小于期望值，

34、该问题一般归于以下两个原因a.cDNA第二链的合成效率不足，以致产生带缺口或带痕量mRNA的双链cDNA分子；b.小片段DNA污染最终的cDNA制齐以 cDNA插入片段中Not I Sal I或EcoRI的位点数多于期望值；cDNA插入片段内 EcoRI位点的出现 频率低于每4kb出现1个位点，该问题归咎于双链 cDNA内EcoRI位点的 甲基化不完全；用适当限制酶消化入噬菌体载体时切割不出cDNA片断，该问题几乎总是由于合成接头未能有效地连接到双链cDNA末端而造成。.DNA的分子大小，分子越大，则摩擦阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢；琼脂糖浓度，一个给定大小的线状DNA片

35、断，其迁移速率在不同浓度的琼脂糖中各不相同； DNA分子的构象；电源电压，在低电压下，线状DNA片断的迁移速率与所加电压成正比。但是，随着分子量的增加，高分子量DNA片断的迁移率将以不同的幅度增长。因此，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围缩小；电场方向；碱基组成和温度；嵌 入染料的存在；电泳缓冲液的组成。.由大量的含有基因组DNA (即某一生物的全部DNA序列)的不同DNA片段的 克隆所构成的群体，称之为基因文库。一个完全的基因文库，应该能够保证从中筛选到目的基因。cDNA文库：若这些大量的重组 DNA分子所含的外源DNA不是基因组DNA ,而是由某一生物的特定器官或特定发育时期细胞内的

36、 mRNA 经反转录形成的cDNA，他们所构成的重组 DNA克隆群体，则称之为cDNA基 因文库。.普遍性转导(Generalized transduction ):供体的单个或紧密连锁的少数几个基因被噬菌体因错误装配而转移给相应受体的现象称为普遍性转导。Phage在供体中裂解中，部分供体 DNA被包装，当感染受体菌时，若感染复数小于 1 时，缺陷phage可将供体DNA注入受体(此时原phage DNA不感染)，形成新的表型不一定稳定，因为供体DNA不一定与受体发生重组，故此类转导称流产转导(abortive transduction ),否贝1J称完全转导( complete transduction )；局限 性转导Specialized (restricted ) transduction :只能使供体的一个或少数几 个基因以噬菌体为媒介转移到受体的转导作用称为局限性转导。低频