血清学诊断技术ppt课件

1、 鸡病血清学检验 一 原 理 许多病毒具有凝集动物红细胞的才干, 这种凝集才干可被相应的抗体所抑制, 故可用知病毒检测相应的血凝抑制抗体 . 也可以用知规范抗体对分别的病毒进展鉴定.红细胞凝集抑制实验 二 运用范围 新城疫、禽流感、减蛋综合征、鸡毒支原体、滑液囊支原体等病原微生物感染后的抗体检测；或相应病原分别后的鉴定 三 器材1.血凝板、2.微量移液器3.规范抗原 4.1%红细胞悬浮液 5.被检血清 6.稀释液四 操作程序一0.5红细胞的预备 1.阿氏液(抗凝剂)的配制 葡萄糖1.866 柠檬酸钠0.8 柠檬酸0.055 氯化钠 0.418g 蒸馏水 100ml 混匀放入100 ml葡萄糖瓶

2、内，10磅115度10分钟 高压灭菌。冷却后4保管备用。2.采血 取安康鸡翅静脉或心脏采血，(按阿氏液2份，血液1份留意:(1). 两只安康的鸡血混合; (2). 阿氏液的量要够3. 红细胞悬液的配制： 将血液注入离心管中，经3000转/分钟，离心5-10分钟，用吸管吸去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，将沉淀的细胞加稀释液生理盐水洗涤，再用离心机3000转/分钟离心5-10分钟，充去上清液，再加稀释液洗涤， 如此反复洗涤三次，将最后一次离心后的红细胞，按1%的稀释度参与稀释液1毫升红细胞泥加99毫升稀释液。(二)被检血清 将被检鸡群编号登记，用消毒过的枯燥注射器采血，注入干净枯燥试管内微量法可

3、用孔经2-3毫米塑料管由翅静脉采血，在室温中静置或离心，待血清析出后运用。 留意: 每只鸡应改换一个注射器，严禁交叉运用。 (三 血凝抗原效价测定 操作量25ul(1)抗原 普通以鸡新城疫II系或Lasota系作为知抗原。 来源: 1).购买: 目前也有用聚乙二醇使Lasota系病毒液浓缩，作 成稳定浓缩抗原，HA效价达1：5000以上，4半年 不变。 2) 自制:A. 用鸡新城疫II系或者Lasota系疫苗接种鸡胚制备抗原：B. 疫苗用灭菌生理盐水稀释10倍，以0.1毫升接种于10日龄的鸡胚尿囊内;C. 凡接种后72-120小时内死亡的鸡胚，且病变显著者，分别收获鸡胚尿囊液于消毒试管内，如有

4、血细胞应离心2000转/分钟15分钟，取上清液;D. 作HA实验，其凝集价在1：640以上的鸡胚鸡，分装于干净枯燥的青霉素瓶中，保管于冰箱备用。 2.抗原血凝价的测定每种抗原做两排，结果取均值 1). 1-12孔加生理盐水25ul 2). 第1孔加抗原25ul，反复吹打10次汲取25ul到第2孔，依此类推倍比稀释至第11孔 3). 最后从第11孔汲取25ul弃去,第12孔做生理盐水对照 4). 一切孔加25ul 1红细胞 5). 将血凝板振荡1分钟 6 新城疫病毒室温1822作用 30分; 禽流感病毒37作用30分.夏季结果出现快，冬季较慢 新城疫病毒时间长，温度高易发生洗脱 7 结果断定 1

5、).完全凝集孔为终点 2).将血凝板成45角竖立察看 3).红细胞呈泪滴状沉淀为不凝集 4).孔底没有红细胞沉淀,红细胞均匀平铺于孔底为凝集,此孔稀释倍数为1个任务单位孔 号12345678910稀释倍数5102040801603206401280对照生理盐水（毫升）病毒液（毫升）4*12525252525252525252525252525252525(25)弃去生理盐水（毫升）252525252525252525250.5%红细胞液（毫升）25252525252525252525作用温度与时间混合均匀置1822作用4560分钟，对照管出现结果时判定结果（举例）+-鸡新城疫红细胞凝集实验HA

6、实验 (过程图)留意 能使鸡红细胞完全凝集的病毒液的最高稀释倍数，称为该病毒液的红细胞凝集效价。如上例，病毒病的HA效价为1：320。 四) 红细胞凝集抑制实验 1. 抗原预备任务浓度的预备 红细胞凝集抑制实验HI实验时，病毒抗原液25ul内需含4个凝集单位，所以，应将原菌抗原毒作成320/4=80倍稀释。 2 操作步骤 (1) 每孔加25ul的稀释液: 第1孔加25ul待检血清，反复吸吹10次; 汲取25ul于第 2孔，以此类推倍比稀释至第11孔; 最后从第11孔取2 5ul弃去,第12孔为抗原对照;(3) 每孔加4单位抗原;室温下( 18-22)作用30分(4) 取1红细胞25ul加于各孔

7、中(5) 将血凝板振荡1分钟(6) 室温作用30-45分钟禽流感 37察看结果(7) 结果断定 将血凝板呈45竖起察看 完全抑制孔红细胞呈泪滴样下沉,此孔为抑制终点.鸡新城疫红细胞凝集抑制实验H实验 (过程图)孔 号12345678910稀释倍数对照生理盐水待检血清2525252525252525252525252525252525(25)弃去4单位抗原252525252525252525250.5%红细胞液（毫升）25252525252525252525作用温度与时间混合均匀置18-22作用45-60分钟，对照管出现结果时判定结果放室温作用分钟单位：l 3.结果报告(1).鸡的免疫临界程度。

8、(2).鸡群的HI抗体程度是以抽检样品的HI抗体效价log2 的平均值表示的。(3).检样中HI抗体效价的最高值与最低值相差太大时，。(4).大型养鸡场，每次进展抽测时，抽样率普通不低于 0.1%-0.5%，小型鸡群，抽样率应有所添加，普通以为 理想的抽样率应为2%。(5.鸡群接种新城疫疫苗后，经2-3周测血清中的HI抗体效 价假设提高2个滴度以上，表示免疫应对良好，疫苗接种 胜利；假设HI抗体效价无明显提高，表示免疫失败。琼脂免疫分散实验AGP 一 原理 抗原、抗体在含有电解质的琼脂凝胶中,可以向周围分散,当抗原抗体分散到适当比列处相结合,出现肉眼可见的沉淀线. 常用知抗原检测相应的抗体适用

9、范围( 琼脂分散实验适用)禽流感、传染性支气管炎传染性法氏囊病、传染性喉气管炎鸡痘、马立克氏病、传染性脑脊髓炎网状内皮组织增生症、病毒性关节炎多杀性巴氏杆菌病的抗体检测。 三 器材琼脂分散板平皿;打孔器、 移液器;0.01M PH 7.2 的磷酸缓冲液;琼脂粉糖 四 操作程序一琼脂板制备 1 琼脂粉1g 磷酸盐缓冲液100ml 2 加热煮沸， 摇动烧瓶使琼脂粉溶解 3 参与8g氯化钠振荡烧瓶，使氯化钠溶解， 4 待琼脂稍凉不烫手，倒板厚度为2.53mm 5 琼脂凝固后，将其倒置湿盒内，4保管备用二 打孔 1 用打孔器按7孔梅花图案打孔 孔径为3mm-4mm,孔距为3mm 大平皿可打六组梅花孔

10、2 打孔后用7#针头挑出孔内琼脂 3 最后在酒精灯上烧烤封底 三 加样 1 中间孔加抗原 2 外周孔加血清 1、4 孔加阳性血清; 其他 孔加待检血清; 加样至满孔为止; 3 室温下放置1020分钟 使孔内液体分散终了或液面下降 4 将琼脂板倒置于湿盒内 37温箱内作用24-72小时察看结果 五 结果断定 一 当阳性血清与抗原孔之间出现明晰沉淀线 证明实验成立 二 假设被检血清与抗原孔之间出现沉淀线 或阳 性血清的沉淀线向临近被检血清孔内侧偏弯者，被检血清判为阳性 三 假设被检血清孔与抗原孔之间没有沉淀线;而且阳性血清孔沉淀线直向被检血清孔那么被检血清判为阴性血 清 平 板 凝 集 试 验 一

11、 原理 细菌性颗粒抗原与相应的抗体结合,在适当的电解质参与下, 经过一段时间抗原颗粒相互凝集成肉眼可见团快. 常用知细菌性抗原检测相应的凝集抗体 凝集实验包括：试管凝集反响 、平板凝集反响全血平板凝集反响、血清平板凝集反响.适用范围 鸡白痢、鸡伤寒 鸡毒支原体、滑液囊支原体 鸡副嗜血杆菌病鸡传染性鼻炎 三 器材 凝集抗原、阳性、阴性血清 被检血清，移液器550ul 载玻片，25灯箱 四 操作程序 一预备 实验前20分钟自4冰箱取出抗原; 阴、阳性血清和被检血清; 使其到达室温，并将抗原液振荡均匀 二实验过程 1. 取抗原液25ul滴于载玻片上 2 . 迅速在抗原液上滴加等量的被检血清 3. 快

12、速用牙签将血清与抗原混匀 4. 并涂布成 2cm大小的片状 5. 在灯箱附近不断晃动玻片2分钟，察看有无凝集 五 结果断定 2 分钟内出现明显凝集背景透亮为阳性;背景均匀一致呈混浊样，无凝集者为阴性. 阴性阳性鸡白痢沙门氏菌的平板凝集实验的察看新城疫病毒、禽流感病毒的分别和鉴定 一 病料的采集和处置 活动物： 气管、喉头、呼吸道分泌物拭子 死动物 ： 肝、脾、肺等内脏用生理盐水肉汤 含双抗2000单位/ml 制成12组织匀浆 4冰箱作用小时或过夜 转分 离心分钟 取上清液备用 二 鸡胚接种 1 取9-11日龄SPF鸡胚，每个样接种5-10个鸡胚 2 取上述处置的上清液0.2ml 接种于鸡胚尿囊

13、腔中 3 37培育4-7天 4 每天照蛋2次，弃去24小时内死亡鸡胚 5 搜集死胚及培育终了时的活胚 放4冰箱中冷却2小时以上过夜 6 收取尿囊液测定其HA活性效价 阴性者需传代2次 三 病毒鉴定 禽流感病毒与其他血清型的副粘病毒 以及某些细菌支原体也具有血凝性 可用相应特异阳性血清进展血凝抑制实验 或全血平板凝集抑制实验进展鉴定 新城疫血凝抑制实验禽流感 琼脂分散实验不同血清型禽流感血凝抑制实验 四 新城疫病毒、禽流感病毒的致病力测定一 鸡胚平均致死时间MDT最小致死量 1 将新颖感染尿囊液进展101-109稀释 2 每个稀释度接种5枚911天 SPF鸡0.1ml/胚 3 置37培育。每日照

14、蛋2次 4 延续察看7天，记录每个鸡胚死亡时间 最小致死量为引起一切鸡胚死亡最大稀释度 MDT最小致死量引起鸡胚死亡平均时间 强 毒60小时 中等毒力61-90小时 低等毒力90小时 二 脑内致病指数IICP 1、取凝集价在24以上的新颖感染尿囊液 用生理盐水10倍稀释； 2、脑内接种1日龄雏鸡24-40小时 10只， 每只0.05ml； 3、 每24小时察看一次，共察看8天； 4、 每天察看给鸡打分，正常鸡为0分； 病鸡为1分；死鸡为2分；鸡每天察看仍记录2分 IICP是每只鸡8天一切察看数值的平均数强毒力病毒ICPI为2，温暖毒数为0 (三 静脉致病指数IVPI 1 将HA高于24的新颖感

15、染尿囊液 用生理盐水做10倍稀释 2 给10只6周龄SPF鸡静脉接种0.1ml 3 每天察看一次，共10天，每次察看记录正常鸡为0，病鸡1， 瘫痪鸡、有神经病症者为2， 死鸡记作3死鸡以后每天仍记3 IVPI指每只鸡10天内察看值的平均数， 温暖型和中等毒力者IVPI为0，强毒株为3禽脑脊髓炎病毒的分别和鉴定 一 采样 一 取发病典型的雏鸡脑组织 发病早期，不超越23天 加含双抗的生理盐水制成1020悬液 二 4作用24小时， 三 1500转离心30分钟，取上清液备用。 二 鸡胚接种 1 取5-7日龄SPF鸡胚5-10枚 2 卵黄接种 将鸡胚垂直放于蛋托上 3 在气室中央打孔， 用7#针头垂直插入剩下1cm左右 4 接种0.2ml病毒液，封蜡 5 37继续孵化11天12天，察看结果 三 结果断定 1 自然感染的野毒不易使SPF鸡胚出现病变 需求传34代才干顺应鸡胚出现病变. 2 取半数鸡胚翻开察看鸡胚察看 肌肉营养不良，腿肌运动性降低 脚趾弯曲等变化 3 另一半鸡胚继续孵化 出壳后10天内便可见到典型AE病症出现 四 病毒鉴定 1 将出现病变的鸡胚脑