微生物的生长繁殖与生存因子

1、在微生物学中提到的在微生物学中提到的“生长生长”，一般均指群体生长，这一点与，一般均指群体生长，这一点与 研究大生物时有所不同。研究大生物时有所不同。 细菌太小，往往讨论其群体生长。细菌太小，往往讨论其群体生长。用于培养微生物的摇床一般摇床都可以控制转速和温度一条典型的生长曲线至少可以分为一条典型的生长曲线至少可以分为 迟缓期迟缓期，对数期对数期，稳定期稳定期和和衰亡期衰亡期等四个生长时期等四个生长时期 生产上延长稳定期的方法：生产上延长稳定期的方法： 补充营养物质（补料）或取走代谢产物；补充营养物质（补料）或取走代谢产物； 调节调节pH、调节温度；、调节温度； 对好氧菌增加通气、搅拌或振荡对

2、好氧菌增加通气、搅拌或振荡（二）连续培养（二）连续培养dN dt=N 菌数增加速率菌数增加速率dN dt=DN 菌数减少速率菌数减少速率一般用于菌体以及与菌体生长平行的代谢产物生产的发酵工业一般用于菌体以及与菌体生长平行的代谢产物生产的发酵工业 缩短发酵周期，提高设备利用率；缩短发酵周期，提高设备利用率； 便于自动控制；便于自动控制； 降低动力消耗及体力劳动强度；降低动力消耗及体力劳动强度； 产品质量较稳定；产品质量较稳定；杂菌污染和菌种退化杂菌污染和菌种退化生物反应器（用于微生物的连续培养或分批培养，可以控制温度、溶解氧、pH等多项指标）以数量变化对微生物生长情况进行测定以数量变化对微生物生

3、长情况进行测定 以数量变化对微生物生长情况进行测定以数量变化对微生物生长情况进行测定 同一稀释度三个以上重复同一稀释度三个以上重复,取平均值；取平均值； 每支移液管及涂布棒只能接触一个每支移液管及涂布棒只能接触一个 稀释度的菌液；稀释度的菌液； 样品充分混匀；样品充分混匀；每个平板上的菌落数目合适，便于每个平板上的菌落数目合适，便于 准确计数；准确计数； 要求：要求：每每ml活菌数同一稀释度平均数活菌数同一稀释度平均数稀释倍数稀释倍数5 注意：要三个以上重复平板平均计数；不适合丝状菌注意：要三个以上重复平板平均计数；不适合丝状菌以数量变化对微生物生长情况进行测定以数量变化对微生物生长情况进行测

4、定 每每ml原液含菌数每小格平均菌数原液含菌数每小格平均菌数400 1000 稀释倍数稀释倍数以生物量为指标测定微生物的生长以生物量为指标测定微生物的生长 测定多细胞及丝状真菌生长情况的有效方法测定多细胞及丝状真菌生长情况的有效方法 以生物量为指标测定微生物的生长以生物量为指标测定微生物的生长 以生物量为指标测定微生物的生长以生物量为指标测定微生物的生长 环境对生长影响环境对生长影响 叶状地衣 （南极石耳） 壳状地衣 （南极中国长城站海边崖岩上的地衣群落） 壳状地衣 （南极丽石黄衣，红色和赤星衣，米黄色） 壳状地衣 （南极的瘿茶渍衣）寄生型的放线菌照片寄生型的放线菌照片金黄色葡萄球菌的生长为本

5、来在平板上不能生长的嗜血流感菌金黄色葡萄球菌的生长为本来在平板上不能生长的嗜血流感菌 提供生长因子，后者在其菌苔周围形成卫星菌落。提供生长因子，后者在其菌苔周围形成卫星菌落。l 性状稳定的菌种是微生物工作最性状稳定的菌种是微生物工作最重要的基本要求，否则生产或科研重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。都无法正常进行。l 影响微生物菌种稳定性的因素：影响微生物菌种稳定性的因素： a a）变异；）变异；b b）污染；）污染；c c）死亡）死亡 菌种衰退（菌种衰退（degenerationdegeneration）是指由于自）是指由于自发突变的结果，而使某物种原有的一系列发突变的结果，而使某

6、物种原有的一系列生物学性状发生量变或质变的现象。生物学性状发生量变或质变的现象。 纯菌种纯菌种自发突变自发突变突变个体突变个体传代增殖传代增殖原始个体原始个体不纯菌种不纯菌种衰退菌种衰退菌种l 菌落和细胞形态改变菌落和细胞形态改变l 生长速度缓慢，产孢子越来越少生长速度缓慢，产孢子越来越少l 代谢产物生产能力下降，即出现负突变代谢产物生产能力下降，即出现负突变l 致病菌对宿主侵染能力下降致病菌对宿主侵染能力下降l 对外界不良条件的抵抗能力下降等对外界不良条件的抵抗能力下降等l 基因突变基因突变主要原因主要原因 1 1、有关基因发生负突变导致菌种衰退、有关基因发生负突变导致菌种衰退 2 2、表型

7、延迟造成菌种衰退、表型延迟造成菌种衰退 3 3、质粒脱落导致菌种衰退、质粒脱落导致菌种衰退l 连续传代连续传代加速衰退加速衰退l 不适宜的培养和保藏条件不适宜的培养和保藏条件加速衰退加速衰退l 控制传代次数控制传代次数l 创造良好的培养条件创造良好的培养条件l 利用不易衰退的细胞移种传代利用不易衰退的细胞移种传代l 采用有效的菌种保藏方法采用有效的菌种保藏方法l 讲究菌种选育技术讲究菌种选育技术l 定期进行分离纯化定期进行分离纯化n 狭义的复壮狭义的复壮消极的措施消极的措施 是指在菌种已经发生衰退的情况下，通过纯是指在菌种已经发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定典型性状、生产性能等指标，从已种

8、分离和测定典型性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的相应措施。到恢复原菌株固有性状的相应措施。n 广义的复壮广义的复壮积极的措施积极的措施 是指在菌种的典型特征或生产性状尚未衰是指在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性状测定工作，以期从中选择到自发的正突变个状测定工作，以期从中选择到自发的正突变个体。体。 菌落纯（菌落纯（“菌种纯菌种纯”）细胞纯（细胞纯（“菌株纯菌株纯”） 通过纯种分离通过纯种分离, ,可将衰退菌种细胞群体可将

9、衰退菌种细胞群体中一部分仍保持原有典型性状的单细胞分离中一部分仍保持原有典型性状的单细胞分离出来出来, ,经扩大培养经扩大培养, ,就可恢复原菌株的典型性就可恢复原菌株的典型性状。状。n 菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原有性状和活力的稳定，确保菌种不死其原有性状和活力的稳定，确保菌种不死亡、不变异、不被污染，以达到便于研究、亡、不变异、不被污染，以达到便于研究、交换和使用等诸方面的需要。交换和使用等诸方面的需要。n 该法是将砂与土分别洗净、烘干、过筛，按一定比例分该法是将砂与土分别洗净、烘干、过筛，按一定比例分装于小试管中，砂土的高度约装于小试管中，砂土

10、的高度约1cm1cm，121121蒸汽灭菌蒸汽灭菌1 11.5h1.5h，间歇灭菌，间歇灭菌3 3次。次。5050烘干后经检查无误后备用。将烘干后经检查无误后备用。将待保藏的菌株制成菌悬液或孢子悬液滴入砂土管中，放线待保藏的菌株制成菌悬液或孢子悬液滴入砂土管中，放线菌和霉菌也可直接刮下孢子与载体混匀，而后置于干燥器菌和霉菌也可直接刮下孢子与载体混匀，而后置于干燥器中抽真空约中抽真空约2 24h4h，用火焰熔封管口，用火焰熔封管口( (或用石蜡封口或用石蜡封口) )，置，置于干燥器中，在室温或于干燥器中，在室温或44冰箱内保藏。冰箱内保藏。 n 此法适用于各大类微生物。此法适用于各大类微生物。n

11、 此法的主要保藏措施是低温、干燥、缺氧、有此法的主要保藏措施是低温、干燥、缺氧、有 保护剂，保藏期一般长达保护剂，保藏期一般长达5 51515年，存活率高，年，存活率高， 变异率低，是目前被广泛采用的一种较理想的变异率低，是目前被广泛采用的一种较理想的 保藏方法。保藏方法。n 该法操作比较烦琐，技术要求较高，且需要冻该法操作比较烦琐，技术要求较高，且需要冻 干机等设备。干机等设备。ATCCATCC采用的两种保藏方法的优点示意图采用的两种保藏方法的优点示意图培养物培养物纯培养物纯培养物混合培养物混合培养物纯培养能较好地得到重复结果纯培养能较好地得到重复结果 ， 是微生物研究的重要技术之一是微生物

12、研究的重要技术之一分离、转接、纯化时防止其他微生物污染的技术分离、转接、纯化时防止其他微生物污染的技术微生物培养常用器皿及灭菌微生物培养常用器皿及灭菌 接种操作，最基本技术接种操作，最基本技术无菌操作台无菌操作台火焰旁无菌区火焰旁无菌区各种菌落各种菌落一、微生物的分离和纯培养一、微生物的分离和纯培养菌落菌落(colony)：单个微生物在固体单个微生物在固体 培养基或内层）生长繁殖形成肉眼培养基或内层）生长繁殖形成肉眼 可见的，有一定形态结构的子细胞可见的，有一定形态结构的子细胞 生长群体。生长群体。 菌落连成片为菌苔（菌落连成片为菌苔（lawn）不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般

13、都具有稳定的特征不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征 （形状、颜色形状、颜色等等），是微生物分类、鉴定的重要依据），是微生物分类、鉴定的重要依据。同一细菌在不同的培养平板上形成不同的特征菌落同一细菌在不同的培养平板上形成不同的特征菌落 常用固体分离纯培养方法：常用固体分离纯培养方法： 稀释平板法稀释平板法常用固体分离纯培养方法：常用固体分离纯培养方法： 涂布平板法涂布平板法平板划线分离平板划线分离一、微生物的分离和纯培养一、微生物的分离和纯培养厌氧罐厌氧罐厌氧手套箱厌氧手套箱有些微生物有些微生物液体培养基液体培养基分离纯培养，原生动物、藻类。分离纯培养，原生动物、藻

14、类。 方法稀释法：方法稀释法： 接种物在液体培养基中顺序稀释，高度稀释，每个试接种物在液体培养基中顺序稀释，高度稀释，每个试管中分配不到一个。若稀释后同一梯度的平行试管中大管中分配不到一个。若稀释后同一梯度的平行试管中大多数（多数（95）没有，那么有微生物的可能是纯培养，）没有，那么有微生物的可能是纯培养，否则可能性下降。否则可能性下降。单细胞（单孢子）显微分离：单细胞（单孢子）显微分离：选择培养分离方法：选择培养分离方法：选择培养分离方法：选择培养分离方法：待分离的微生物生长，其它微生物的生长被抑制待分离的微生物生长，其它微生物的生长被抑制选择培养分离方法：选择培养分离方法：富集培养富集培养

15、 特定的环境条件特定的环境条件仅适应于该条件的微生物旺盛生长仅适应于该条件的微生物旺盛生长待分离微生物在群落中的数量大大增加待分离微生物在群落中的数量大大增加从自然界中分离到所需的特定微生物从自然界中分离到所需的特定微生物根据微生物的特殊要求，从自然界分离出特定已知微生物种类；根据微生物的特殊要求，从自然界分离出特定已知微生物种类；分离培养在特定环境中能生长的微生物；分离培养在特定环境中能生长的微生物；富集培养富集培养 普通显微镜结构示意图普通显微镜结构示意图显微镜种类和原理：显微镜种类和原理：目镜：目镜：10 15 ；物镜：；物镜： 100 ；总放大倍数；总放大倍数10001500 ； 如何

16、实现光学显微镜一般配置的最大放大倍数？其原理？如何实现光学显微镜一般配置的最大放大倍数？其原理？使用油镜，即在使用油镜，即在100 物镜和载玻片之间滴加香柏油；物镜和载玻片之间滴加香柏油； 香柏油与玻璃折射率相近香柏油与玻璃折射率相近分辨率与所用波长成反比！分辨率与所用波长成反比！分辨率与所用波长成反比！分辨率与所用波长成反比！空气（空气（n=1.0）、水（）、水（n=1.33）、香柏油（）、香柏油（n=1.52）显微观察时可根据物镜的特性而选用不同的介质显微观察时可根据物镜的特性而选用不同的介质 光线在穿过折射率不同的介质时发生折射光线在穿过折射率不同的介质时发生折射 很多原来由于在透镜及载

17、片表面的反射和折射而损失的很多原来由于在透镜及载片表面的反射和折射而损失的 光线可以进入物镜，使照明亮度提高，改善观察效果。光线可以进入物镜，使照明亮度提高，改善观察效果。活细菌在普通显微镜下是透明，观察不清，采用暗活细菌在普通显微镜下是透明，观察不清，采用暗视野显微镜，如：黑夜看星星就很清楚。视野显微镜，如：黑夜看星星就很清楚。 暗视野显微镜结构与照明示意图暗视野显微镜结构与照明示意图特殊聚光器实现斜射照明，给样品照明的光线不直接特殊聚光器实现斜射照明，给样品照明的光线不直接穿过物镜，而经样品反射或折射后进入物镜，使样品穿过物镜，而经样品反射或折射后进入物镜，使样品与背景差别大，可以清楚看到

18、透明微小颗粒。用于：与背景差别大，可以清楚看到透明微小颗粒。用于：生活细菌运动性观察。生活细菌运动性观察。光线透过透明标本，光线透过透明标本，波长（颜色）波长（颜色）和和振幅（亮度）振幅（亮度）没有多大变化，用普通显微镜观察透明标本，其形态没有多大变化，用普通显微镜观察透明标本，其形态和内部结构难以分辨。细胞各部分折射率和厚度不同，和内部结构难以分辨。细胞各部分折射率和厚度不同，当光线通过时，直射光和衍射光光程有差别，而人眼当光线通过时，直射光和衍射光光程有差别，而人眼看不到，但是可通过相差显微镜看到。看不到，但是可通过相差显微镜看到。 相差显微镜相差显微镜采用特殊光学装置：采用特殊光学装置：

19、环状光阑环状光阑和和相差板相差板，利用光的干涉，将光的相位差转变为人眼可见的振幅利用光的干涉，将光的相位差转变为人眼可见的振幅差（明暗），使能不染色而看到活细胞及细胞内的某差（明暗），使能不染色而看到活细胞及细胞内的某些显微结构。其发明人些显微结构。其发明人F.Zernike因此获因此获1953年诺贝尔年诺贝尔物理奖。物理奖。荧光素吸收荧光素吸收uv放出波长较长的可见光，因此在放出波长较长的可见光，因此在uv照射下，照射下，发荧光的物体会在黑暗背景显现为光亮有色物体，为荧发荧光的物体会在黑暗背景显现为光亮有色物体，为荧光显微技术原理。在免疫学和分子生物学应用广泛。光显微技术原理。在免疫学和分子

20、生物学应用广泛。用波长短的电磁波取代可见光，用波长短的电磁波取代可见光，使分辨率提高。使分辨率提高。 工作原理类似，因光源不同，有工作原理类似，因光源不同，有区别区别: 电子若遇空气中分子会发生偏转电子若遇空气中分子会发生偏转使物象不清楚，因此镜筒高真空使物象不清楚，因此镜筒高真空 2)电子带电荷，电镜是用电磁圈电子带电荷，电镜是用电磁圈使之聚焦使之聚焦 3)电子像人眼看不到，用荧光屏电子像人眼看不到，用荧光屏显示或感光胶片记录显示或感光胶片记录大肠杆菌大肠杆菌 透射电子显微镜图透射电子显微镜图扫描电子显微镜扫描电子显微镜大肠杆菌扫描电镜图大肠杆菌扫描电镜图二、显微镜和显微技术二、显微镜和显微

21、技术工作原理与光学显微镜和透射电子显微镜不同，是电子束扫描，激工作原理与光学显微镜和透射电子显微镜不同，是电子束扫描，激发样品表面放出二次电子，电子产生多少与标本表面立体形貌有关。发样品表面放出二次电子，电子产生多少与标本表面立体形貌有关。电子经探测器收集，经光电倍增管和放大器，产生样品立体图像于电子经探测器收集，经光电倍增管和放大器，产生样品立体图像于荧光屏上。荧光屏上。 主要用于：样品表面结构主要用于：样品表面结构80年代出现的，原理：利用量子力学中的隧道效应。年代出现的，原理：利用量子力学中的隧道效应。 其横向分辨率：其横向分辨率：0.10.2nm，纵向分辨率：，纵向分辨率：0.001nm 这种分辨率足以对单个原子观察。这种分辨率足以对单个原子观察。 利用这种显微镜直接观察蛋白质、利用这种显微镜直接观察蛋白质、DNA、RNA等以及等以及CM、virus等结构。等结构。 厨房抹布上的细菌和霉菌厨房抹布上的细菌和霉菌棉纤维上的汗垢棉纤维上的汗垢扫描隧道显微镜下的扫描隧道显微镜下的DNA样品好坏直接影响观察结果。样品好坏直接影响观察结果。 考虑因素：根据所用显微镜特点采用合适制样考虑因素：根据所用显微镜特点采用合适制样方法，尽可能使样品生理结构稳定，采用各种方法，尽可能使样