细胞毒性试验方案

1、细胞毒性实验设计方案1.胰酶 双抗(青霉素/高DMEM(糖)链霉素)DAPI准备材料：MTT(5mg/mL) DMSO PBS 4% 指甲油 6 孔培养板 多聚甲醛 培养瓶(25mL) 96孔培养板 超 薄载玻片一包 0.45滤膜 m 以 灭菌： 50mL , 10mL , 5mL离心管两种枪头2.实验方案材料本实验所用的为载药的通过二硫键桥连透明质酸的 夹心二氧化硅(SiO2-SS-HA/DOX ),在高谷胱甘肽条件下，二硫键断 裂，透明质酸脱离，同时SiO2-本实验的夹心二氧化硅中药物得以释放。目的为测定透明质酸修饰的夹心二氧化硅(，SiO2-SS-HASiO2-SS-HA/DOXSS-H

2、A/DOX )的细胞毒性。实验组为、 DOX成纤维细胞为正常人肝癌细胞为肿瘤细胞模型和分别采用，HepG2 L929 空白对照组为纯细胞细胞模型。SiO2-SS-HA/DOX 、 HepG2 人肝癌细胞为肿瘤细胞模型，实验组为采用1%（w/v） DOXSiO2-SS-HA 、，空白对照组为纯细胞。10%（v/v）培养基中含有FBS和、。配制不同浓度的链霉素青霉素双抗（/ ） SiO2-SS-HA/DOXSiO2 HA 药物载、DOX体培养基溶液。HepG2以人肝癌细胞为肿瘤细胞模型（1）.12% DMEM 87%1%血清培养基的配置：双抗具体操作步骤：细胞的复活：C温水中，使细胞快速溶解。将悬

3、浮的细将冻存于液氮中的细胞取由，迅速放入 37无血清培养基，5mL胞移至离心管中，力口 1000rmp,5min 离心（每次转移时，将之前的离心管洗涤，5mL去上清，再加 有血清培养基，转移至培养瓶中。并用移液枪来回吸，使液体混合均匀。）将培养瓶放入培养箱中培养。细胞的传代：C,每次使用一管，避的胰酶分装至小离心管中，0.25% 将，冻存于2mL每个管中-20免反复冻融。的酒精放入超净台。将培养液倒入废液75%将培养瓶从培养箱中取由，盖子旋紧，喷 缸，操作完成后，残留培养基用吸管吸干净，培养瓶口 -用火烧。加入2mL胰酶将瓶底铺满，消化 2-3min ,于显微镜下观察细胞形态，呈2mL 12%

4、 DMEM 终止消化，用枪吹打，使细胞悬浮。圆形，即消化完毕，加入离心。迅速倒掉上清，加入 10mL离心管中，1000rmp,5min,将细胞悬浮液移入 6mLDMEM 培养基,分装至两个培养瓶中，再各加入培养箱中培养 48h。，于37 C, 5%的 CO22mLDMEM至5mL-。下一次传代步骤同:细胞存活率测定方法(布板，加样)。同传代步骤 -并用移液枪来回吸，使液体混合均匀，将所有含给每个离 心管中加入定量的培养基，有细胞的培养基转移到一个50mL离心管中，最终使液体体积为30mL。个复孔，每块板设一组空白调零孔，内加培养液，不含 96孔板中每个浓度设计 5细胞与药物，一组空白对照组，只

5、加培养基和细胞，不加药物。除过空白调零孔，每孔加入， 5% (v/v) CO 2 L 含细 胞的培养基。将孔板放入培养箱中，培养箱保持一定的湿度， 100 2 22小时。温度保持在 37 C,培养微升的0.03g将谷胱甘肽加入到10mL培养基，充分溶解，浓度为 0.003g/mL, 取20.003g/mL 谷胱甘肽溶液加入到 10mL的培养基中，将这两个浓度含谷胱甘肽的培养基替换部分原来的培养基，作为对照，不需要加谷胱甘肽的孔换上5% (v/v) CO 2 ,温新鲜培养基，将孔板放入培养箱中，培养箱保持一定的湿度，小时，具体的加样孔见图一。2度保持在37 C,培养的培养基中，分成两份，其中 3

6、mL样品溶到SiO2-SS-HA/DOX 1.2mg 将的的培养基，再将稀释后的含液样的培养基分成两份，1.5mL一份里加入 其中一份SiO2-SS-HA/DOX 样 新鲜培养基，依此类推，便得到一个浓度梯度的加入 1.5mL品。SiO2-SS-HA 样品的浓度配制方法同上。的0.918mg 将 SiO2-SS-HA/DOX的培养基中，剩下3mL。所示。将孔板放入培养箱孔板中的培养基，如图 96 1将配制好的载体溶液替换原来37,温度保持在C,培养5%(v/v) CO2 中，培养箱保持一定的湿度，24小时。5 mg/mL 配制的 溶液，将孔板中的培养更换成MTTMTT溶液，将孔板放-入培养箱中

7、，培养箱保持一定的湿度，5% (v/v) CO 2 ，温度保持在37 C。培养4小时后，mm us: .和*工»| kF Lp- iF .)1 A JK将孔板中的培养基取由，用PBS溶液清洗3次，然后向每孔加入100以L的DMSO ,溶解孔中的甲瓒，采用酶标仪测定，波长设定为 490nm图1药物载体布板示意图.以L929成纤维细胞为正常细胞模型 实验组为 SiO2-SS-HA/DOX 、SiO2-SS-HA、 DOX ,空白对照组为纯细胞。实验目的为测定药物载体溶液对正常细胞 的细胞毒性。培养基的配置：双抗 1%血清 12% DMEM 87%具体操作步骤：细胞的复活：C温水中，使细胞

8、快速溶解。将悬浮的细37将冻存于液氮中的细胞取由，迅速放入离心胞移至离心管中，加5mL 无血清培养基， 1000rmp,5min（每次转移时，将之前的离心管洗涤，去上清，再加 5mL有血清培养基，转移至培养瓶中。并用移液枪来回吸，使液体混合均匀。）将培养瓶放入培养箱中培养。细胞的传代：C,每次使用一管，避 2mL ,冻存于-20将0.25%的胰酶分装至小离心管中，每个管中 免反复冻融。的酒精放入超净台。将培养液倒入废液将培养瓶从培养箱中取由，盖子旋紧，喷 75% 培养瓶口缸， 残留培养基 用吸管吸干净，操作完成后，用火烧。,于显微镜下观察细胞形态，呈圆形，即2-3min 2mL加入胰酶将瓶底铺

9、满，消化终止消化，用枪吹打，使细胞悬浮。消化完毕，加入 2mL 12% DMEM离心。迅速倒掉上清，加入将细胞悬浮液移入10mL离心管中，1000rmp,5min,培养基，分装至两个培养瓶中，再各加入6mLDMEM。48h CO2 5% 37 5mL2mLDMEM ,至，于C,的培养箱中培养下一次传代步骤同-。细胞存活率测定方法（布板，加样） ：同传代步骤-。并用移液枪来回吸，使液体混合均匀，将所有含给每个离 心管中加入定量的培养基，离心管中，最终使液体体积为50mL 12mL。有细胞的培养基转移到一个个复孔，每块板设一组空白调零孔，内加培养液，不含孔板中每个浓度设计 5 96细胞与药物，一组

10、空白对照组，只加培养基和细胞，不加 药物。除过空白调零孔，每孔加入，以 100 5% (v/v) CO 2 L含细胞的培养基。将孔板放入培养箱中，培养箱保持一定的湿度， 温度保持在 37 22 C,培养小时。- 将所有加样的孔换成新鲜培养基，作为与癌细胞的对照。将孔板放入培养箱中，培养箱保持一定的湿度，5%(v/v)CO2 ,温度保持在 37 C,培养 2小时。将0.4mg 的SiO2 -SS-HA/DOX 样品溶到 1mL的培养 基中，分成两份，其中一份里加入0.5mL的培养基，再将稀释后的含液样的培养基分成两份，其中一份加入 0.5mL新鲜培养基，依此类推，便得到一个 浓度梯度的 SiO2

11、-SS-HA/DOX 样品。 SiO2-SS-HA 样品 的浓度配制方法同上。1mL的培养基中，剩下的步骤同 0.306mg 的SiO2-SS-HA/DOX 样品溶到将。o,所示。将孔板放入培养箱将配制好的载体溶液替换原来96孔板中的培养基，如图 2,温度保持在 37 C,培养中，培养箱保持一定的湿度，5%(v/v) CO2小时。24溶液，将孔板放入培养箱中，MTT配制5 mg/mL 的溶液，将孔板中的培养更换成MTT小时后，将孔板中的培培养箱保持一定的湿度，5% (v/v) CO 2，温度保持在 37 Co培养4,溶解孔中的甲瓒，采DMSO以L的3养基取由，用PBS溶液清洗次，然后向每孔加入100490nm用酶标仪测定，波长设定为二(ODtreated -ODblank /OD control -:细胞存活率细胞存