TIRFM在纳米粒子近壁浓度测量中的应用

1、TIRFM在纳米粒子近壁浓度测量中的应用王绪伟 李战华作者简介：王绪伟（1984-），男，甘肃会宁人，博士生。研究方向：纳米粒子受限布朗运动。Email:wangxw基金项目：国家自然科学基金项目（10872203）和中科院知识创新工程（KJCX2-YW-H18）中国科学院力学研究所非线性力学国家重点实验室，北京 100190摘要：相比于传统的体照明方式，全内反射（TIRF）照明具有背景干扰小、垂向分辨率高等优点，可用于定量观测液-固界面的流动现象。本文介绍LNM实验室TIRFM系统调试中的技术参数，初步测量了距离玻璃表面500nm高度内f200nm粒子的浓度分布，并与经典的Boltzmann

2、公式进行比较。1. 引言Aranuld Serge（2008）1利用粒子的细胞表面的受限运动理论绘制了细胞表面形貌的动态变化；郑旭等（2009）2使用Micro-PIV实验测量微流道壁面的滑移长度，发现示踪粒子浓度在管道壁面的非线性分布可能引起表观滑移长度偏大。这些现象引起了人们对粒子-壁面相互作用的关注1-3，而粒子浓度在近壁区的非均匀分布，也称为depletion layer，是其中的一个基本问题，但是对与近壁粒子浓度的直接测量比较困难。近几年得到迅速发展的全内反射隐失波（TIRF）技术4照明范围在距离壁面500nm以内，z向分辨率可达30nm，可有效用于近壁区粒子浓度分布测量。本文主要介

3、绍了TIRFM测量中的技术问题，并初步使用TIRFM测量距玻璃表面500nm以内的f200nm粒子在纯水中的浓度分布。2. TIRF原理及参数调整(1) TIRF原理根据Snell透射定律：当光线从介质1进入介质2时，介质的折射率与光线入射角或折射角的乘积守恒（图1L），用数学表示为 (1)图1 TIRF原理其中n1和 n2为介质1和介质2的折射率，q1和 q2分别为光线入射角和折射角。当折射角q2为90º时，没有光进入介质2,称为全反射，相应的入射角称为临界角 (2)水的折射率n2=1.33，玻璃n1=1.52，可以得到临界接触角qcr为61.4度。对给定的物镜，最大入射角由物镜的

4、数值孔径NA确定 (3)对100X NA=1.45的油镜，最大入射角为72.5度。当入射角范围为时，绝大多数光发生全反射，但有一部分光会以平行界面的方向传播，称为隐失波（图1）。TIRF照明厚度内光强I(z)（即隐失波强度）分布为： (4)其中I(0)为壁面（z=0）处的光强，照明厚度的特征尺度称为穿透厚度dp (5)其中l为激发光的波长。对532nm激光，对应于不同的入射角，穿透厚度的取值范围为：72340nm。(2) 入射角与调节器刻度的关系入射角的大小是由TIRF照明器的调节器控制的。厂家给出的入射角与调节器刻度之间的关系为 (6)其中a和b分别为光束平行于物镜折射和有一定偏斜折射时的刻

5、度，f为物镜焦距（为3）。但使用中发现，a和b与所使用的实验系统有关。我们重新标定了调节器刻度b与入射角q 的关系，如图2所示。图2 入射角与TIRF调节器刻度b的关系拟合得到入射角与TIRF调节器刻度b的关系为：sinq =0.38b-7.3 (7)(3) 穿透深度与z向分辨率根据公式(3)，通过测量粒子光斑的光强I(z)可以得到粒子在z向的位置，从而实现对粒子的三维追踪。根据误差传递，z向定位的误差： (8)对于粘附在壁面的粒子，光强I0=5000时，sIo=400，可得入射角q=61.4°时，误差Dz=31nm。3. 实验装置与方法实验装置包括Olympus IX71倒置荧光显

6、微镜，配有数值孔径NA=1.45的100倍TIRF油镜；物镜型TIRF照明器IX2-RFAEVA2（Olympus）；激光器Compass 315M（Coherent）；图像采集用DU885 EMCCD(Andor)。实验用直径200nm的Polystyrene 荧光粒子 (Invitrogen)，粒径的误差<2%。在超纯水(Millipore)中稀释至体积分数约为10-5。荧光粒子的实验溶液配置好后5-10min内开始实验。将约50mL含纳米荧光粒子的溶液滴到载玻片上，液滴的直径约3mm。用CCD记录液滴中的荧光粒子，在bin2模式下图幅为501×502像素，像素尺寸为160

7、nm/pixel。实验示意见图3。在同一平面内，观测5-7个位置，每一空间位置连续拍摄50帧图片，连续两帧的时间间隔t为24.05ms,其中包括图像曝光时间(3ms)和图像传输时间。实验持续时间为20-25min。典型的粒子图像如图4所示。用3个液滴重复上述实验。环境的相对湿度为40%-50%，每次实验中，湿度偏差小于±4%。实验温度在22-23.5±0.1，单次实验过程中温度变化小于±0.3。使用单粒子追踪法5对图像进行粒子识别、轨迹匹配后得到50帧图像中所有光斑在x-o-y平面内的位置和光斑最大灰度。TIRFM中粒子光斑的灰度可以转换为z向位置（公式4），由此

8、可以进一步得到粒子浓度随z向的分布。 图3. 物镜型TIRF照明实验示意图 图4. TIRF照明下200nm粒子图像4. 近璧粒子浓度测量(1) Boltzmann分布公式C.I. Bouzigues（2008）6认为，纳米粒子在固体表面附近的浓度分布主要是由于粒子-壁面的静电排斥作用引起的。在水溶液中，固体表面会吸附/脱附化学基团，从而产生表面电势。带电表面附近的电势分布为 (9)其中kB为Boltzmann常数，T为绝对温度，0为固体表面电势，lD为Debye长度。 在电势场中，点电荷的浓度分布服从Boltzmann分布 (10)其中qp为粒子表面电荷量。(2) TIRFM测量结果我们对f

9、200nm的粒子在近壁面的浓度进行测量，3次实验得到的结果如图5所示。左图为原始数据，其中各次实验测差异是由于每次配液中浓度不尽相同。为了显示粒子-壁面相互作用的效果，我们使用500-600nm切片厚度内粒子数密度的均值对原始数据分别进行归一化（右图），可以看出它们的规律一致。图5 粒子浓度沿着z向的分布。(L)归一化前, (R)使用最后5个数据的均值归一化(3) 与理论Boltzmann分布的比较理论上，超纯水中的Debye长度在考虑pH影响时为150nm7，粒子表面电荷约-3e，玻璃的表面电势约-40mV，代入式（9）和（10）可得到理论分布如图6所示，可见理论与实验结果的趋势一致。图6

10、近壁粒子浓度分布5. 结论本文对LNM实验室的TIRFM系统进行了调试，给出了入射角标定公式并对z向定位精度进行了分析。利用该系统进行了f200nm粒子在近壁区浓度分布的测试。测试结果表明，利用TIRFM系统测量得到的粒子浓度在z向分布的形式基本符合Boltzmann分布，但其中参数的确定还需要进一步的研究。参考文献1. A. Serge, N. Bertaux, H. Rigneault and D. Marguet, Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes.

11、Nature Methods, 2008, 5(8): 6876942. X. Zheng and Z. H. Silber-Li, The influence of Saffman lift force on nano-Particles concentration distribution near wall, Applied Physics Letter, 2009, 95(12): 1241053. Simon Biggs, Dennis C. Prieve and Raymond R. Dagastine, Direct Comparison of Atomic Force Micr

12、oscopic and Total Internal Reflection Microscopic Measurements in the Presence of Nonadsorbing Polyelectrolytes, Langmuir, 2005, 21 (12): 542154284.A. Daniel, Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology, 2001, 2(11): 764-7745.王绪伟，李战华. SPT方法在纳米粒子布朗运动观测中的应用. 实验流体力学，2008，22(1): 8487.6.C.I. Bouzigues, P. Tabeling and L. Bocquet, Nanofluidics in the Debye layer at hy