抗氧化剂和NFκB对大鼠肺微血管内皮细胞iNOS表达的影响

1、    抗氧化剂和NFB对大鼠肺微血管 内皮细胞iNOS表达的影响        摘要目的：探讨NFB在大鼠肺微血管内皮细胞iNOS基因诱导表达中的作用及抗氧化剂对内皮细胞iNOS诱导表达的影响及其机制。方法：Griess法测定细胞培养上清液NO-水平以反映NO的生成，Northern印迹分析iNOS mRNA水平，EMSA法测定细胞核内NFB的结合活性。结果：抗氧化剂可阻断内皮细胞培养体系LPS和TNF诱导的NO生成及iNOS mRNA的表达；LPS和TNF可诱导

2、大鼠肺微血管内皮细胞NFB的激活并可被抗氧化剂阻断。结论：LPS和TNF 诱导的内皮细胞iNOS基因表达依赖于NFB的激活；抗氧化剂可通过抑制NFB的活化而阻断iNOS基因的诱导表达。主题词一氧化氮；抗氧化药；内皮中分类号R318.04文献标识码A文章编号1000-4718(2000)01-0020-04 Effect of antioxidant and NFB on the induction of iNOS gene in rat pulmonary microvascular endothelial cells in vitroLIU Qing-hang, JIN Hui-ming,

3、WU Zhao-hui, CHEN Yu, LIU Kai(Department of Pathophysiology, Shanghai Medical University, Shanghai 200032, China)Abstract AIM:To investigate the role of nuclear factor B (NFB) in the induction of iNOS gene by TNF and LPS in endothelial cells and the effect of antioxidant on the induction of iNOS. ME

4、THODS:Nitrite was determined based on Griess reaction. iNOS mRNA was analyzed using Northern blot. NFB in the cell nucleole was detected with electrophoretic mobility shift assay.RESULTS:(1)NO production and iNOS mRNA expression induced by LPS and TNF was blocked by pyrrolidine dithiocarbamate(PDTC)

5、 or N-acetylcysteine(NAC). (2)LPS and TNF triggered the activation and translocation of NFB, and PDTC or NAC inhibited the activation of NFB induced by LPS and TNF.CONCLUSIONS:(1)The induction of iNOS gene by TNF and LPS is dependent on the activation of NFB.(2)Antioxidants may inhibit the induction

6、 of iNOS gene through the inhibition of NFB activation.MeSHNitric Oxide; Antioxidants; Endothelium内皮细胞在多种细胞因子或内毒素作用下表现出一些新的特性，如细胞表面粘附分子及主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)抗原的表达，产生一系列细胞因子及诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)的表达，使内皮参与活跃的免疫反应，此过程称为内皮细胞的激活1。内皮细胞的过度激活将导致内皮细胞出现一系

7、列表型变化并产生如动脉粥样硬化和类风湿性关节炎等。其中内皮细胞iNOS的过度表达所致的内皮细胞低反应性及内皮细胞的损伤在炎症、免疫性疾病及内毒素休克的发病过程中具有重要意义。研究表明内皮细胞激活时iNOS表达的调控主要发生在转录水平。iNOS基因的启动子区域含有多个转录因子的结合位点包括NFB、AP-1、NF-IL6，Oct-1等2，而核因子B(nuclear factor B, NFB)被认为在多种参与炎症反应的蛋白质因子的基因调控中担任重要角色，因而可能是内皮细胞激活的调控中一个重要转录激活因子2，3。据报道巨噬细胞，肾系膜细胞中iNOS的表达依赖于NFB的活化，但NFB与内皮细胞iNOS

8、基因诱导表达的关系报道较少。本文探讨NFB在大鼠肺微血管内皮细胞iNOS基因诱导表达中的使用。另外，抗氧化剂被认为是NF活化的有效抑制剂，因而，本文亦研究抗氧化剂对于LPS和TNF诱导的内皮细胞iNOS表达的影响及其机制。材料和方法一、材料：重组人肿瘤坏死因子-(recombined human tumor necrosis factor-， TNF-)，大肠杆菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)，pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC)，N-acetylcysteine(NAC)购自Sigma公司，无酚红DMEM培养基，小牛血清购自Gibco

9、公司，Dig High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit , Dig Gel Shift Kit购自Boehringer Manhaim公司。二、方法：(一)细胞培养：大鼠肺微血管内皮细胞的分离培养参照我们以往报道的方法4。选用体重100 g左右的雄性SD大鼠，乌拉坦腹腔注射麻醉，腹腔内注射肝素(1000 U/100 g BW)，左心室切口，从右心室缓慢灌注10 mL D-Hanks液至肺叶颜色变白。小心剪取边缘肺组织，进而剪切成1 mm×1 mm×1mm小块，按12块/cm密度接种于培养瓶，用含20%小牛血清的DME

10、M培养液培养6070 h后去除组织块，换液，直至长成致密单层。此细胞已应用抗vWF抗体及内皮细胞抗体CD31进行免疫组化鉴定并应用相差显微镜和电镜进行形态鉴定，非内皮细胞少于5%4。使用传代至23代的细胞，细胞在加入药物处理前12 h所用培养液血清浓度降为0.5%。进行NO?水平测定用的细胞培养体系使用无酚红DMEM培养基。(二)NO水平的测定：根据Griess反应原理，用我室改良的方法测定细胞培养上清液中NO?水平以反映NO的生成4。培养上清液经离心后取100 L加入等量的Griess反应液1%磺胺；0.1% N-1-萘乙二胺(溶剂为5%磷酸)混匀，室温放置10 min，应用酶标比色仪Bio

11、rad 450于540 nm处进行光密度测定，根据标准曲线换算为NO-浓度。(三)探针的制备与标记：应用RT-PCR方法制备用于Northern杂交的探针5。所用的引物序列为：(1)GAPDH：5-AGA TCC ACA ACG GAT ACA TT-3；5-TCC CTC AAG ATT GTC AGC AA-3；(2)iNOS:5-GTG TTC CAC CAG GAG ATG TTG-3；5-CTC CTG CCC ACT GAG TTC GTC-3。所得的PCR产物经低溶点琼脂糖凝胶分离并纯化用以制备探针。探针的标记应用“Dig High Prime DNA Labeling and

12、Detection Starter Kit ”试剂盒，按说明书进行地高辛随机引物法标记并检测标记效率。(四)Northern印迹分析：细胞总RNA抽提采用文献报道的一步法，1%琼脂糖-甲醛变性胶电泳，毛细管法转移至尼龙膜，预杂交3 h，杂交过夜，洗膜。应用“Dig High Prime DNA Labeling and Detection Start Kit ”试剂盒检测，至观察到蓝紫色条带后即终止反应。条带经光密度扫描，将比值(iNOS mRNA/GAPDH mRNA)进行统计分析。(五)EMSA(electrophoretic mobility shift assay)：核蛋白的提取参照S

13、ingh等的方法6。核蛋白质定量采用考马斯亮兰G-250染色法。NFB识别的特异性双链DNA序列5-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3采用地高辛标记，步骤参见“Gel Shift Kit”说明。取4 g核蛋白质与标记的双链探针混合，室温下孵育30 min，然后进行6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，缓冲液为0.25×TBE， 4电泳23 h，电泳后的凝胶转移至尼龙膜，固定，应用“Dig Gel Shift Kit”试剂盒进行检测。(六)统计分析：数据以<"01.jpg (732 字节)" src="/med/cano/2010

14、03/20100310161311392.jpg" 15 17>±s表示，应用t检验测试均数差异显著性。结果一、抗氧化剂可阻断内皮细胞培养体系NO的诱导生成：大鼠肺微血管内皮细胞经LPS(1 g/mL)和TNF(100 U/mL)作用24 h后，细胞培养上清液NO?水平显著高于对照组(P0.01， n=5)。提示LPS及TNF可诱导大鼠肺微血管内皮细胞NO的生成。而在培养体系预先加入抗氧化剂PDTC(0.1 mmol/L)或NAC(20 mmol/L)1.5 h则可显著抑制LPS及TNF诱导的NO的生成(P0.01，n=5)(1A)。另外，抗氧化剂PDTC及NAC对内

15、皮细胞NO诱生的抑制作用呈现剂量-效应关系(1B，C)。     Fig 1Accumulation of nitrite in rat pulmonary microvascular endothelial cells(RPMECs) culture medium(A)RPMECs were treated with LPS(1 g/mL)+TNF (100 U/mL) for 24 h, or preincubated for 1.5 h with PDTC (0.1 mmol/L) or NAC (20 mmol/L) then for the n

16、ext 24 h with LPS(1 g/mL)+TNF(100 U/mL).(B)RPMECs were preincubated with various concentrations of PDTC for 1.5 h and for the next 24 h with LPS (1 g/mL)+TNF(100 U/mL).(C)RPMECs were preincubated with various concentrations of PDTC for 1.5 h and for the next 24 h with LPS(1 g/mL)+TNF(100 U/mL)1大鼠肺微血

17、管内皮细胞培养上清液NO?水平的变化二、LPS和TNF可诱导大鼠肺微血管内皮细胞NFB的激活：应用LPS(1 g/mL)和TNF(100 U/mL)处理大鼠肺微血管内皮细胞2 h，即可观察到较明显的NFB结合活性；而应用PDTC(0.1 mmol/L)或NAC(20 mmol/L)预处理1.5 h后则NFB的结合活性被显著抑制(P0.05，n=3)(2)。提示抗氧化剂可以抑制LPS及TNF对内皮细胞NFB的激活及核内转位。    Fig 2EMSA of NFB in RPMECs(1)Control (2) LPS(1 g/mL)+TNF(100 U/

18、mL)(3)LPS (1 g/mL)+TNF(100 U/mL)+PDTC(0.1 mmol/L)(4)LPS (1 g/mL)+TNF(100 U/mL)+NAC(20 mmol/L)2大鼠肺微血管内皮细胞NFB结合活性的EMSA分析(在相同实验条件下重复3次，得到类似结果)三、抗氧化剂可阻断大鼠肺微血管内皮细胞iNOS mRNA的诱导表达：Northern Blot分析表明未经刺激的大鼠肺微血管内皮细胞iNOS mRNA水平不能检出，而加入LPS(1 g/mL)和TNF(100 U/mL)处理2 h，则观察到iNOS mRNA明显的诱导表达(光密度值升至0.375±0.086，与

19、对照组比P0.05，n=3)。预先应用抗氧化剂PDTC或NAC处理1.5 h则可显著抑制TNF及LPS诱导的iNOS mRNA表达水平(光密度值分别降至0.018±0.011及0.026±0.019，与TNF+LPS组比P0.05，n=3)，而GAPDH mRNA的表达水平则不受PDTC及NAC的影响(P0.05，n=3)(3)。    Fig 3(A)RT-PCR amplification of iNOS and GAPDH mRNA in RPMECs1.LPS (1 g/mL)+TNF (100 U/mL)2.RPMECs(C

20、ontrol)3.4.GAPDH(B)Northern Blot analysis of iNOS mRNA using cDNA probes(1)Control (2) LPS(1 g/mL)+TNF (100 U/mL) (3)LPS(1 g/mL)+TNF (100 U/mL)+PDTC(0.1 mmol/L) (4)LPS (1 g/mL)+TNF(100 U/mL)+NAC(20 mmol/L)3(A)大鼠肺微血管内皮细胞iNOS及GAPDH mRNA的RT-PCR扩增(B)大鼠肺微血管内皮细胞iNOS表达的Northern Blot分析(在相同实验条件下重复3次，得到类似结果)讨

21、论内皮细胞的激活往往表现为一系列特定基因的表达。目前的研究表明，这些基因结构存在一个共同点，即其5端启动子区域的NFB的结合位点，其中iNOS基因亦具有NFB的调控作用位点。本文发现内毒素及TNF可激活微血管内皮细胞NFB并使之向核内转位，而应用抗氧化剂PDTC或NAC则可抑制NFB的激活并同时抑制细胞因子及内毒素诱导的iNOS mRNA水平及NO的生成。为排除抗氧化剂对基因表达的非特异性作用，我们观察到PDTC或NAC对GAPDH的组成型表达并无明显影响，且GAPDH基因的5调控区并无NFB的结合位点，这表明抗氧化剂主要是通过影响内皮细胞iNOS基因诱导表达的相关信号转导过程，即抑制NFB的

22、活化而起作用的；并且提示内皮细胞iNOS基因的诱导表达依赖于NFB的激活。NFB作为一种转录活化因子，通常以NFB/Rel转录因子家族的异源二聚体的形式与DNA相结合发挥转录调控作用，其中的NFB1(P50)和RelA(P65)亚单位二聚体为常见。NFB在静息的内皮细胞胞浆中与其抑制蛋白(inhibitor of NFB， IB)相结合。当内皮细胞激活时IB被磷酸化进而降解使之与NFB二聚体解离，于是活化的P65-P50二聚体迅速由胞浆转位至胞核，与DNA的靶向序列相结合并激活转录。抗氧化剂可以抑制NFB的活化过程，提示活性氧可能是NFB活化的重要介质。NFB可以作为一个重要的靶分子应用于伴有

23、内皮细胞过度激活的病理过程如炎症，动脉粥样硬化，败血症等。虽然糖皮质激素作为一种常用的抗炎药物，可以抑制NFB的激活及细胞促炎分子的表达9，但糖皮质激素的副作用影响了它们的长期使用。抗氧化剂作为一种小分子化学物质通过抑制NFB的活化过程而阻断细胞粘附分子、细胞因子3、iNOS等分子的基因表达，因而抗氧化剂可能成为此类疾病的治疗中具有应用前景的一类药物。刘清行（上海医科大学病理生理教研室，上海 200032）金惠铭（上海医科大学病理生理教研室，上海 200032）吴朝辉（上海医科大学病理生理教研室，上海 200032）陈愉（上海医科大学病理生理教研室，上海 200032）刘凯（上海医科大学病理生

24、理教研室，上海 200032）参考文献1Asasa S, Ono S, Seki S, et al. Inhibitory effect of protease inhibitor on endothelial cell activation J. J Surg Res, 1998, 80(2):182190.2Lowenstein CJ, Alley EW, Raval P, et al. Macrophage nitric oxide synthase gene:two upstream regions mediate induction by interferon and lipopol

25、ysaccharide J. Proc Natl Acad Sci USA, 1993, 90:97309734.3Ferran C, Millan MT, Csicmadia Vilmos, et al. Inhibition of NFB by pyrolidine dithiocarbamate blocks endothelial cell activation J. Biochem Biophys Res Commun, 1995, 214(1):212223.4刘清行，金惠铭. TNF对大鼠肺微血管内皮细胞NO的产生及NOS mRNA表达的影响J.上海医科大学学报，1999，26(1)：47.5Lee CC, Wu X, Gibbs RA, et al. Generation of cDNA probes directed by amino acid sequence cloning of uratic oxidase J.