人B淋巴母细胞株Yam1B产生具有免疫抑制作用的因子

1、    人B淋巴母细胞株Yam 1B产生具有 免疫抑制作用的因子        【 摘要 】目的对Yam 1B细胞自发产生的一种可抑制人T、B细胞增殖的可溶性因子(Yam-SF)进行研究。方法3H-TdR掺入法进行淋巴细胞增殖抑制测定，ELISA法测定免疫球蛋白，间接免疫荧光法测定IL-2R，CTLL-2细胞3H-TdR掺入法测定IL-2活性。结果Yam-1B培养上清(Yam-SF)经pronase水解消化而失活，经56处理10分钟，或在pH10环境中处理

2、6小时抑制活性丧失，在pH2.0环境中可保持其抑制活性。凝胶过滤试验表明，培养上清抑制活性分布在分子量4300067000范围内，且TGF-抗体不能阻断其抑制活性。 结论Yam-SF可能是一种新的免疫调节因子，该因子可抑制人T细胞及B细胞的增殖，并抑制正常B细胞免疫球蛋白的产生，但对PHA剌激的人淋巴细胞IL-2的产生以及IL-2受体(IL-2R)的表达无抑制作用。【 主题词 】免疫调节细胞因子B淋巴母细胞 A soluble immunosuppressive factor released by Yam 1B cell of a human B-lymphoblastoid cell li

3、neZhang Yongfa*,Ruan Linhai, Zhang Yuzhen,et al.*Xinxiang Medical College,Xinxiang 453003AbstractYam 1B,a human B lymphoblastoid cell line, spontaneously produced an immunoregulatory factor,which suppressed the proliferation of human T and B lymphocytes and inhibited immunoglobulin generation by nor

4、mal B cells.The serum-free Yam 1B culture supernatant inhibited neither the expression of IL-2 receptor nor the production of IL-2 in the lymphocytes stimulated with PHA. The inhibitory activity of Yam 1B supernatant(Yam-SF) was inactivated at 56 for 10 min and at pH10.0 for 6h and abrogated by dige

5、stion with pronase, but remained at pH2.0. Gel-filtration column assay showed a peak of inhibitory activity in the fraction containing molecules of apparent MW of 43kD to 67kD. The inhibitory activity was not blocked by the anti-TGF-beta antibody. These results indicate that Yam-SF appear to produce

6、 a novel immunoregulatory factor.Subject wordsImmunoregulationCytokinsB lymphoblastoid cells在自身免疫病等难治性免疫相关疾病的发病机制中，免疫调节功能失调及变态反应发挥着重要作用。而近年来的一系列研究表明，由B细胞产生并释放的细胞因子在免疫调节以及变态反应的调节中极为重要15，在这些因子中，既有增殖因子也有包括TGF-在内的非特异性抑制因子6，7。1993年，日本学者森川等从一成人T细胞性白血病(ATL)患者末梢血细胞中建立了Yam 1B细胞株，该细胞株细胞膜表面表达SmIgG及CD23等B细胞表面标记

7、，细胞内IgM+，培养液中有少量IgM(10100ng/ml)释放，T细胞系、髓系及粒系表面标记阴性，ATL病毒相关抗原(ATLA)阴性，表明Yam 1B细胞为B细胞系细胞8。我们的初步实验发现，Yam 1B 细胞在培养中可自发产生一种对人T细胞及B细胞增殖具有抑制作用的可溶性因子。我们对该抑制因子(我们称之为Yam-SF)进行了详细的研究。材料与方法试剂与单克隆抗体：RPMI 1640培养基、PHA-P、ConA、PMA、SAC、Ficoll-Hypaque、Sephacryl S-300以及3H-TdR均购自华美公司，鼠抗人TGF-抗体及TGF-购自Pharmacia公司。细胞株：Yam

8、1B 由日本岛根大学森川茂教授惠赠，CTLL细胞为本室保存，B淋巴细胞株1E8和前B淋巴细胞株679均购自ATCC公司。Yam 1B细胞培养上清抑制因子：5×105/ml Yam 1B细胞于无血清RPMI 1640培养基中培养72小时，收获上清，浓缩50700倍备用。取浓缩培养上清过Sephacryl S-300层析柱，并检测其淋巴细胞增殖抑制活性。淋巴细胞制备：将手术摘出的人扁桃体制成单细胞悬液，以Ficoll-Hypaque密度梯度离心，收集单个核细胞，以花环沉降分离法9分离纯化T细胞和B细胞。为进一步纯化B细胞，上述方法中收集非花环形成细胞以Percoll不连续梯度离心(4，2

9、500r/min,25分钟)，收集60%/70%界面间细胞即获得高密度小B淋巴细胞。健康人外周血淋巴细胞的制备方法同上。淋巴细胞增殖抑制试验：以含10%胎牛血清的RPMI 1640制备106/ml的淋巴细胞悬液，于96孔板中加入105/孔，然后分别加入一定剂量的PHA-P、ConA、PMA或SAC。实验组加入50倍浓缩的Yam 1B培养上清，使每孔液体量达到0.2ml；空白对照组则加入等量的RPMI 1640；1E8或679对照组则加入等量的50倍浓缩的1E8或679细胞培养上清，于5% CO2，37条件下培养72小时，收获前8小时加入3H-TdR10l，使其终浓度为18.5kBq(0.5Ci

10、)/ml，收获并测定其3H掺入量。免疫球蛋白产生及检测：105/孔人外周血单个核细胞(RBMNC)或扁桃体MNC在PWM(最终稀释度150)存在或不存在条件下，加入或不加入50倍浓缩的Yam 1B或1E8或679培养上清，于5% CO2，37条件下培养7天，收集培养上清，以ELISA法测定其中IgM和IgG含量。IL-2的产生，IL-2R表达及检测：105/孔 PBMNC在PHA-P(最终稀释度1100)存在或不存在条件下，加入或不加入50倍浓缩的Yam 1B或1E8或679培养上清，于5% CO2，37条件下培养48小时，分别收集细胞及培养上清，采用间接免疫荧光法测定IL-2R10，上清中I

11、L-2活性测定采用CTLL-2细胞3H-TdR掺入法11。结果Yam 1B上清对T、B淋巴细胞增殖的抑制作用：如1A所示，Yam 1B培养上清可显著抑制PHA-P、ConA及PMA剌激的T细胞增殖反应，而且这一抑制作用呈明显的Yam 1B上清浓度依赖性，当加入不经稀释的50倍浓缩的Yam 1B培养上清时，T细胞的增殖被完全抑制；Yam 1B培养上清对SAC及PMA剌激的B细胞增殖也呈浓度依赖抑制(1B)。而1E8及679培养上清则无抑制作用。1Yam 1B上清对扁桃体T、B淋巴细胞增殖的抑制作用Fig 1. Inhibitory effect of Yam 1B supernatant on

12、the proliferation of tonsil T(A) or B(B) lymphocytes A:PHA,Con A,PMA;B:PMA,SAC2Yam 1B 上清抑制活性分析Fig 2. Analysis of the inhibitory activity of Yam 1B supernatant 3H-TdR incorporation of PHA-P stimulated PBMNC;Protein concentration-;Molecular weight markers: Ferritin,LDS,BSA,OA,Cyt CYam 1B上清抑制免疫球蛋白的产生：在

13、PWM剌激下，PBMNC和扁桃体MNC可产生IgM和IgG型免疫球蛋白，其中PBMNC产生免疫球蛋白的能力明显高于扁桃体MNC，且以产生IgM为主。当在培养体系中加入Yam 1B培养上清时，则PBMNC和扁桃体MNC免疫球蛋白的产生均受到明显抑制，而且，这一抑制作用呈明显的Yam 1B上清浓度依赖性(表1)。而1E8及679培养上清则无抑制作用。 表1Yam 1B培养上清对PWM剌激的PBMNC和扁桃体MNC免疫球蛋白产生的影响Table 1. Effect of Yam 1B supernatant on the immunoglobulin productionin PBMNC or to

14、nsillar MNC culture system stimulated by PWMCell source PWMYam-SF(%, vol/vol)Amount of Ig(ng/ml)IgMIgGPBMNC0423100208770896865530112113.12659187*610112* 6.21346165*300100*12.51125122*16268*251151103*8940*TonsillarMNC01026224972027552032293200 3.121872431477238*6.21339116*124176*12.5104155*56762*2511

15、1279*44677*P0.01 compared with “PWM()， Yam-SF(0)” group Yam-SF的理化性质：Yam 1B培养上清在pH10的环境中处理6小时其抑制活性丧失，而在pH2.0的环境中则可保持其抑制活性；当将其加热至56处理10分钟也可使其失活，而-20冻存则可保持其活性；以蛋白水解酶，如pronase处理该培养上清同样可使其失活。凝胶过滤实验表明，培养上清抑制活性分布在分子量(4367)×103范围内，其峰值活性位于48.5×103(2)。Yam-SF与TGF-活性比较：105PBMNC在PHA-P(最终稀释度1100)剌激下培养3天

16、，可出现明显的淋巴细胞增殖反应，而当加入Yam 1B培养上清(终浓度12.5%vol/vol)后，这种增殖反应受到明显抑制，且Yam 1B培养上清对淋巴细胞增殖反应的抑制作用不被TGF-抗体所阻断；同样，加入TGF-(终浓度1ng/ml)后，这种增殖反应受到明显抑制，但TGF-对淋巴细胞增殖反应的抑制作用则被TGF-抗体所完全阻断(表2)。Yam 1B培养上清对IL-2受体及IL-2产生的影响：如表3所示，PBMNC在PHA-P剌激下培养48小时，可有明显的IL-2产生，加入Yam 1B培养上清对IL-2的产生无影响；Yam 1B培养上清对IL-2受体的产生也无抑制作用。1E8及679培养上清

17、亦无抑制作用。表2抗TGF-抗体不能阻断Yam 1B培养上清的抑制活性Table 2. Antibody to transforming growth factor-beta does notblock the inhibitory activity of Yam 1B supernatantGroupPHAYam-SFAnti-TGF-antibodyTGF-Lymphocyte proliferation3 H-TdR incorporation(cpm)1-3656519282-2011386*3-2298295*4-3528320435-7221216-15283347-8121008

18、-2355152*9-342392780*10-710132*P0.01 compared with group 1, *P0.05 compared with group 2, *P0.001 compared with group 8 表3Yam 1B培养上清对PBMNC IL-2产生及IL-2R表达的影响Table 3. Effect of Yam 1B supernatant on the production of IL-2and the expression of IL-2R of PBMNCPHA-PYam-SFNIL-2(U/ml)IL-2R(%)-3.

19、7-12121.6011.950.25.3612116.1010.0*51.15.77*-125.5*P0.05 compared with “PHA-P(), Yam-SF(-)” group 讨论在参与免疫应答及其调节的细胞因子中，有增殖因子，如IL-2等，也有抑制因子，如TGF-、IFN-6，7等。其中由B细胞产生的抑制因子主要有IFN-及TGF-等。我们的结果显示，Yam 1B，一株来源于ATL患者外周血的B淋巴母细胞细胞株可以产生并分泌一种蛋白质类免疫抑制因子，这一抑制因子(Yam-SF)在pH10的环境中处理6小时其抑制活性丧失，而在pH2.0的环境中则可保持

20、其抑制活性；当将其加热至56处理10分钟也可使其失活，而-20冻存则可保持其活性；以蛋白水解酶，如pronase处理该培养上清同样可使其失活。其分子量在(4367)×103范围内，其峰值活性位于48.5×103。Yam-SF不但可以抑制T细胞及B细胞的增殖，而且可以明显抑制IgG类及IgM类免疫球蛋白的产生，但不抑制IL-2的产生及IL-2受体的表达。从理化性质上来看，Yam-SF无论是分子量还是对pH及温度的敏感性均与IFN-等存在着明显的差异；而与TGF-相比，二者对pH及温度的敏感性均无明显的差异，即使其发挥作用的特点也存在着明显的一致性；即二者的抑制作用均不通过IL

21、-2及IL-2受体调节系统。为此，我们进一步比较了Yam-SF与TGF-的活性，结果显示，Yam-SF的抑制活性不能被TGF-抗体所阻断，但TGF-的抑制活性可以被TGF-抗体完全阻断，这一结果清楚地表明，Yam-SF与TGF-不是同一种细胞因子，尽管二者的理化性质及作用特点存在着明显的一致性。关于Yam-SF的进一步研究尚在进行之中。本项目受河南省自然科学基金资助(9504162058)作者单位：453003 新乡医学院(张永法，张玉珍)；河南医科大学一附院(宋永平)；洛阳医学专科学校(阮林海)参考文献1Adolf G R,Hass O A,Fischer P,et al.Spontaneo

22、us production of alpha and beta interferons in human lymphoblastoid and lymphoma cell lines. Arch Virol, 1982, 72169-178.2Gordon J,Ley S C,Melamed M D,et al.:Soluble factor requirements for the autostimulatory growth of B lymphoblasts immortalized by Epstein-Barr virus.J Exp Med,1984,1541554-1559.3F

23、ord R F,Kwok D Queseda J,et al.Production of B-cells from hairy cell leukemia patients.Blood,1986,67573-581.4Sung J S-S,Jung L K L,Walters J A,et al.Production of tumor necrosis factor/cachectin by human B cell lines and tonsillar B cells.J Exp Med,1988,1681539-1551.5Sterm A S,Podlaski,F J,Hulmes J D, et al.Pur