基础生物化学实验.

1、生物化学实验实验基本原理1有效数字计算（结合电子天平的应用等）加减法：进行数字加减时，最后结果所保留的小数点后的位数应与参与运算的各数中小数点后位数最少者相同，其尾数“四舍五入”。女口： 0.124+1.2345+12.34=13.6979 应取13.70。乘除法：进行数字乘除时，最后结果的有效数字应与参与运算的各数中有效数字位数 最少者为准，而与小数点的位数无关，其尾数“四舍五入”。如口： 1.23X 0.12=0.1476, 应取0.15。2误差分析误差为实验分析的测定值与真实值之间的差值。误差越小，测定值越准确，即准确度越高。误差可用绝对误差和相对误差表示。绝对误差二测定值-真实值相对误

2、差 二绝对误差+真实值X 100%一般用相对误差表示结果的准确度， 但因真实值是并不知道的，因此实际工作 中无法求出分析的准确度，只得用精确度来评价分析的结果。3偏差分析（结合“可溶性蛋白或赖氨酸实验”要求掌握）精确度表示在相同条件下，进行多次实验的测定值相近的程度。一般用偏差来 衡量分析结果的精确度。偏差也有绝对偏差和相对偏差两种表示方法。绝对偏差二单次测定值-算术平均值（不计正负号）相对偏差 二绝对偏差-算术平均值X 100%例如：分析某一材料糖含量，共重复测定5次，其结果分别为：16.1%, 15.8%,16.3%, 16.2%，15.6%，用来表示精确度的偏差可计算如下:分析结果算术平

3、均值个别测定的绝对偏差（不计正负）16.1%0.1%15.8%0.2%16.3%16.0%0.3%16.2%0.2%15.6%0.4%平均绝对偏差 =（0.1%+0.2%+0.3%+0.2%+0.4%）宁 5 = 0.2%平均相对偏差 二0.2宁16.0X 100% = 1.25%在实验中，有时只做两次平行测定，这时就应用下式表达结果的精确度：两次分析结果的差值宁平均值x 100%4实验结果的表述：实验结果可用列表法“影响酶作用的因素”常用）和 作图 法（综合实验用）表示。第1章分光光度技术分光光度技术是光学（光谱）分析技术的一种，它是利用物质的 特征吸收光谱 来对不同物质进行定性和定量分析的

4、一项技术。我们将重点介绍紫外光-可见光分 光光度法。一、紫外光-可见光分光光度法的基本原理1、讨论的波长范围：200400nm的紫外光区和400760nm的可见光区。人肉眼可见的光线称可见光，波长范围在 400760nm;200400m为紫外光区，760400000nm为红外光区2、发射光谱与吸收光谱：发射光谱:不同光源发射光谱不同。对电灯来说， 钨灯发射可见光源，氢灯发 射紫外光源。吸收光谱：被溶液吸收后的光谱。（在分光镜上呈现暗带的光谱）。当一束单色光通过溶液时，一部分被溶液吸收，一部分光可反射、折射、吸收、 透过溶液的厚度愈大，光过越少。3、吸收光谱中的透光度（T）与吸光度（A）:吸收光

5、谱类仪器的检测读数盘上都有两种数字，T或A （或E消光度）（1）透光度（T）：表示透过的光占入射光的比例（表示）当一束光通过一杯样品溶液时，射光二反射光+折射光+吸收光+透过光当用空白（组成该样品溶液的溶剂）校正后，入射光二吸收光+透过光透光度（T）=样品透过光强度/空白透过光强度此时空白透过光强度是样品真正入射光强度。（2）吸光度（A）：是物质所吸收的光的一种度量，数值上等于透光度的倒 数的对数（透光度的负对数），即A = -lgT（3） 朗伯-比尔定律：A = K C L，吸光度与溶液浓度（C）和液层厚度（L） 成正比。（K为常数，同种物质K相同，不同物质K不同）如固定L （比色皿厚度），

6、A只与C成正比。朗伯-比尔定律使用条件：待测液是均匀稳定的稀溶液；入射光是严格 的单色光。4、分光光度法（比色法，P23）：（1）定义：利用分光光度计产生的单色光照射待测溶液，通过检测吸光度，对溶 液中存在的具有光吸收能力的物质进行定性或定量分析的方法。（2）测定方式：用已知标准浓度和未知浓度的待测液进行比色分析，根据两者 间的吸光度做比较求得待测液的浓度。 还需设置“空白”，以消除光的反射和折射。（3）光源：通过钨灯或氢灯产生可见光或紫外光。二、分光光度法的测量方法1、标准曲线法：配制一系列不同浓度（C）的标准溶液，以纯溶剂为空白，测定 标准溶液的A值，以A值为纵坐标,C为横坐标绘制标准曲线

7、。2、 回归方程法：得到的标准曲线数据可通过一元线性回归求出标准曲线方程。（见 P27附。具体应用，先确定x和y，再按公式计算）。3、 仪器直读浓度法：7200等分光光度计可直接读出浓度。只需配出一个C标，校正仪器至已知浓度，将待测液推入光路，旋钮拨至C档，即可直接读出浓度。4、列解联立方程法：对于多组分和二组分混合液可选择多个或两个波长（一般为各组分的最大吸收波长）分别测出吸光度（A）,再按方程组计算。（P124,实验29属于此类）三、分光光度法的应用（见 P26）参考原则:?有紫外吸收的可选用紫外分光光度计测定，如蛋白质、核酸、生物碱、硝酸盐等?无色的物质可通过显色用可见分光光度计测定，如

8、蛋白质、氨基酸、核酸、酶、糖类等?有色的物质可直接用可见分光光度计测定，如色素。四、紫外-可见分光光度法测定物质浓度的一般操作（P27）1、配制标准溶液,制标准曲线2、样品准备和提取:称样浸提（加热或研磨）稀释至一定浓度显色（紫外 不必）3、 测定：选择适当波长选择适当比色皿倒入待测液调节仪器 读数记 录4、计算:根据公式，带入各数据计算结果。思考题（1）分光光度法的基本原理如何？应用在哪些方面？（2）结合实验，总结分光光度法测定物质含量的一般操作过程和注意事项。（3）简述分光光度计的组成及使用方法。（4）名词：透光率，吸光度，吸收光谱，标准曲线第2章离心技术1、概念:1）离心：是利用离心机产

9、生离心力来分离具有不同沉降系数的物质的方法。2）离心技术（centrifugal method）是利用离心机旋转运动产生的离心力，将悬浮 液中的悬浮微粒快速沉降，而达到分离、浓缩或提纯等目的的一门技术。应用：在生物科学，尤其是在生物化学和分子生物学方面的应用已经十分广泛。2、基本原理：物质颗粒在离心过程中受到的作用力主要有 离心力、介质阻力 和介质浮力等。1）离心力（F ）：定义：物质颗粒在离心场中受到一个远离旋转轴的力即为离心力。表示：常用地球引力的倍数表示，“数字x g”（g为重力常数）。例如25000 x g,则表示相当于地球引力的25000倍（高速离心）实际应用中，特别是低速离心，常用

10、每分钟转数v表示（r min-1或rpm）。2）浮力密度：物质的质量减去在一定介质中所受的浮力即为浮力密度。只有物体的密度大于介质密度的情况下，该物体才会发生沉降。3）沉降阻力：物体在介质中沉降时，所受到的介质阻力。沉降阻力取决于介质的粘度。4）沉降速度：即单位时间内物质颗粒移动的距离。它与物体的密度成正比，与介质的摩擦系数（粘度）成反比。3、离心机的分类（P10）可从转速、用途、离心形式、转子形式、使用温度等方面对离心机进行分类。 根据离心机转速不同，可分为三类：低速（普通）、高速和超速离心机。（1）普通离心机：转速在8000 rpm或6000X g以下，一般性制备用（一般实验 中用）。（2

11、）高速离心机：转速可达 25000 rpm或89000x g,需要带有冷却离心腔的制 冷设备，以控制转子高速旋转产生的磨擦热。（3）超速离心机：转速在30000 rpm以上，可产生高达500,000x g的离心力; 可使亚细胞器、病毒分级分离，也可用于测定蛋白质、核酸的相对分子量等。由 于转速极高，因此它除带有制冷设备外，还具备真空系统。4、常用离心技术1）差速离心法：基于待测物质颗粒的大小、密度不相同，其沉降速度不一样而 得到分离。2）速率区带离心（沉降速度超速离心）:样品中粒子（大分子）因大小和沉降速度不同，在梯度介质中呈分离的区带状沉降,（管中形成区带）。同样的粒子处于同一区带（图1-1

12、-4 ）首先在离心管中灌装好预制的一种密度梯度介质液，在其上面小心铺上一层样 品溶液（图1-1-4 ），离心期间，样品中各组分会按照各自的沉降速率沉降，被 分离成一系列的样品组分区带，故称 率区带离心。3）等密度梯度离心（沉降平衡超速离心）:样品中粒子（大分子）因浮力密度不 同，粒子移至它本身相同密度的地方形成区带（管中形成区带）（图1-1-5 ）。如果离心管中介质中的密度范围包括待分离样品中所有组分的密度，离心过程中， 各组分将逐渐移至与它本身密度相同的地方形成区带。速率区带法和等密度梯度法的区别：开始介质有无梯度（前者有，后者无但在离心中自动生成）；介质不同（前者可用蔗糖、甘油等，后者常用

13、碱金属的盐溶液）。5、离心技术的应用1）物质的分离：将固体与液体分离，或将互不相溶的液体分开。2）测定沉降系数和分子量：超速离心6、离心操作的一般过程1）仪器选择：根据需要选择2）离心准备：样品装入离心管，做好标记并进行平衡。再按对称方向放到离心机 中。3）离心：关闭离心腔盖，调整旋钮或按钮至设定时间及转速（低速离心机逐渐增 速）开始离心。4）检测、分离已离心样品：取出离心管，用长吸管、移液器、注射针头等工具吸 取所需的液体分离层，或直接倾去液体层，留下所需的固体层。思考题（1）何为离心技术？它有什么用处？（2）简述离心机的分类。（3）结合实验，说明普通离心操作应注意哪些问题。（4）名词：离心

14、力，沉降系数，沉降速度，差速离心，等密度梯度离心第3章层析技术定义：层析技术（层析法）是根据物质的理化性质而建立的分离、分析物质的 方法。（P15）发现历史：层析法也称色谱法，是1906年俄国植物学家将植物叶片提取的 色素通过装填有CaCO3的柱子，各种色素以不同速率流动后形成不同的色 带而被分开，由此得名为 色谱法”层析法不断发展，相继出现气相层析、高压液相层析、薄层层析、亲和层析、 凝胶层析等。层析法是生物化学中常用的分离分析技术之一。一、层析法的基本原理层析法是利用混合物中各组分物理、化学性质的差异（如吸附力、分子形状及 大小、分子亲和力、分配系数等）,使各组分在两相（固定相和流动相）中

15、发生相 互作用（吸附、溶解、结合等）使各组分以 不同速度移动而达到分离的目的。1、分配系数（K）:通常被用来描述一种化合物在互不相溶的两个相中的分配状况。溶质在固定相中的浓度溶质在移动相中的浓度2、分离原理（P15）（见图1-2-1 ）3、层析法分类1）按层析过程的机理（依据的理化性质）分类2）按两相的物态（固、液、气）分类3） 按操作形式（支持物、装置等）分类（见P17,表1-2-1层析法分类表）4、几种层析方法简介1）分配层析（1）原理：利用混合物在两种不相混溶的液相（固定相和流动相）中的分配系数 不同，分配系数小的溶质在流动相中的分配的数量多，移动快；分配系数大的溶 质在固定相分配的数量

16、多，移动慢。（2）应用：纸层析，以滤纸上吸附的水为固定相，以有机溶剂为流动相，常用于 分离鉴定氨基酸、核苷酸、色素等小分子有机物。物质在纸上的移动速率可以用 R值表示：_物质斑点中心至起点中 心距离Rf =溶剂前沿至起点中心的距离在相同条件下，Rf值是固定的，可用于鉴定被分离的物质。2）吸附层析（1）原理：利用固定相的固体吸附剂表面对不同组分吸附力的大小及流动相对它 的溶解作用（解吸作用）的差异进行分离。（2）应用：薄板层析是常用的吸附层析方法之一。它用水作粘合剂将硅胶 G均匀 铺在玻璃板上形成一薄层作为固定相， 由展开剂作为流动相，可用于分离氨基酸、 单糖、寡糖、脂类等。3）离子交换层析（1

17、）原理：固定相的离子交换剂对各种离子有不同的亲和力，它们结合的牢固程 度不同，选用不同pH的洗脱液做流动相便可将混合物中的各种离子逐个洗脱下 来。（2） 应用：离子交换柱层析常填充不溶性高分子化合物（树脂，纤维素等），以 分离各种可解离的物质，如蛋白质、氨基酸、核酸、生物碱等。4）凝胶层析（分子筛层析或分子排阻层析）（1）原理：根据混合物中各分子的大小和形状不同而进行分离。固定相为多孔网 络结构的凝胶颗粒。当各种分子流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入胶 孔，在凝胶颗粒间的空隙向下移动，最先被洗脱出来；比网孔小的分子能自由出 入胶孔内外，在柱内经过的路程较长，移动慢，最后被洗脱出来。（2）

18、应用：大分子分离提纯，测蛋白质分子量。5、 层析技术的一般操作过程：以柱层析薄层层析为例，对层析的操作过程简介如下：1）层析柱（板）的制作：装柱:将层析介质（如树脂、葡聚糖颗粒等）均匀、致密地填充于层析柱中, 并用洗脱液或样品缓冲液平衡一定时间（见下图）制板：层析介质（如硅胶G）用溶剂调匀后平铺于玻板上，待晾干后进行活 化。2）加样或点样：加样：用于柱层析，待分离样品溶解后加于层析柱顶上：点样：用于薄层层 析或纸层析，用毛细管等细小管状物将待分离样品点于薄层的一端。3）洗脱或展层：用流动相流过固定相的过程在柱层析中称为洗脱，在薄层层析中称为展层4）检测与鉴定：根据样品性质特征用不同方法思考题（

19、1）简述层析法的基本原理及分类？（2）凝胶层析的原理如何？（3）简述层析技术的一般操作过程，层析技术可应用在哪些方面?（4）名词：展层，洗脱，制板，分配系数第4章电泳技术定义：电泳技术是根据带电颗粒在电场中向着与其所带电荷相反电极移动的 原理建立的分离分析物质的方法。(P30)历史：1808年就发现电泳现象，但作为一种生物化学研究方法，在1937年后才得到了较大发展。目前，电泳技术已成为生物化学、免疫学、分子生物学以及与其密切相关的 医学、农、林、牧、渔、制药分析中必不可少的手段。一、电泳的基本原理1、带电质点:不同物质由于本身解离或其表面吸附有其它带电质点，在电场中便会向一定 电极移动。aa

20、、Pr和核酸都可两性解离，带有电荷。2、 迁移率(m):表示不同带电颗粒在电场中的泳动速度，其单位为cm2 -V-1 s-1:m =颗粒泳动速度(cm s-1) /电场强度(cm V-1)3、影响迁移率的主要因素：(1) 内因：带电颗粒的性质和颗粒的大小状般说颗粒带净电荷越多，直径 越小，越接近球形，在电场中迁移率越快，反之越慢。(2) 外因：电场强度、溶液pH值、溶液的离子强度、电渗现象、温度的影响。二、电泳的分类1、按分离原理分类：(P32)分为区带电泳、移界电泳、等速电泳和聚焦电泳等 4种。区带电泳最常用， 电泳过程中，不同的离子成分在均一的缓冲液体系中分离成独立的区带。2、按有无固体支

21、持物分类: 分为自由电泳和支持物电泳两大类支持物电泳的支持物有多种，应用最多。根据支持物的特点又可分为：（1）无阻滞支持物，如滤纸、醋酸纤维膜、纤维素粉、淀粉、聚酰胺粉末，凝胶 颗粒等。（2）有阻滞支持物，通常为高密度的凝胶，如淀粉凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂 糖凝胶等。用于放置支持物的电泳槽的形式也是多种多样的，有垂直的、水平的、柱状的（花篮式）、毛细管的、湿小室及幕状的等。聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作支持物的区带电泳。PAG盼离物质的三种效应：（1）电荷效应:按所带电荷分离物质。（2）分子筛效应:凝胶聚合成三维网状结构，通过控制网孔大小分离不同大小的 分子。（3） 浓缩

22、效应:当使用不连续凝胶系统时，分离物质快速通过浓缩胶（大网孔）、 而聚集于分离胶（小网孔）上呈一薄层，使分离物质处于同一起跑线。因为以上三种效应，使分离物质的分辨率提高。2、聚丙烯酰胺凝胶的聚合：聚丙烯酸胺凝胶是由单体、丙烯酰胺（简称 Acr）和交联剂、双体的 N,N- 甲叉双丙烯酰胺（简称 Bis）在加速剂（四甲基乙二胺）和催化剂（过硫酸 铵）的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。（见图1-4-2）三、聚丙烯酰胺凝胶电泳?凝胶孔径大小，主要受凝胶浓度的影响。凝胶浓度越大，孔径越小。凝胶浓度过大，胶硬而脆，易折断。3、PAGE的应用(1) 分离蛋白质和同工酶：(P38)形成不同的蛋白带和酶带(

23、参见实验 10及下图)(2) 测定蛋白质分子量：采用SDS-PAGE。在样品中加十二烷基硫酸钠(SDS)隆低天然蛋白质分子 间的电荷差别，蛋白质结构变得松散，形状趋于一致，使各种SDS-蛋白复合物在电泳时产生迁移率差异只与分子量有关。(3) 测蛋白质等电点：采用等电聚焦电泳法(IEF-PAGE)。在凝胶柱中加入两性电解质载体，造d 一定的pH梯度，使具有不同pl值的蛋白质聚焦在相应的pH中，这时所带 净电荷为零，不再泳动，而浓缩成狭窄的区带(参见 P36及P55)。4、凝胶电泳的一般操作方法：(1) 根据所分离物质的特性及要求选择相应的凝胶、电泳仪及电泳槽(园盘、垂直 板、多用途) 配制相应凝

24、胶溶液(烧杯中，参见 P65 )(3) 灌胶：花篮式电泳装置，在玻管中倒入凝胶溶液，直接加水覆盖胶液(4) 胶凝固后倾出水，将玻管固定于电泳槽，倒入电极缓冲液并检查是否漏液(5) 点样：将样品加至凝胶上的上样孔中(6) 电泳：接上电泳仪开始电泳(7) 剥胶、显色(8) 分析：条带比较或照相或光密度扫描思考题什么叫电泳？简述电泳的基本原理。什么叫迁移率？电场强度、pH、温度对迁移率有何影响？凝胶电泳技术可应用在哪些方面？名词：等电聚焦，区带电泳，分子筛效应，浓缩效应。实验1影响酶作用的因素1、酶具有什么特性？（1）高效性：酶的催化效率一般比无机催化剂高 1000万至10万亿倍，因此在生物体内的各

25、种酶只需要极少的量就能催化大量底物发生反应。（2）专一性：指酶对催化的底物及反应类型具有选择性，所以酶的种类很多。（3） 易变性：酶是蛋白质，要求温和的反应条件；在一定范围内，温度、PH值等变化都会使酶的催化能力发生变化。（4）可调性：植物通过调节酶的活性进行不同的反应和适应不同的环境。2、什么是酶的活性？酶催化效率的高低。3、酶的活性需要什么条件？需要 适应环境的条件一一其中适宜的温度和 PH值就是其中之一。根据酶的特性及需要的条件，下面分别给出不同的温度环境、不同的PH环境 和催化底物，来探讨酶的活性需要的条件。原理：淀粉酶活性高低不同，淀粉水解的程度就不同，生成的产物也不同；其水解产物遇

26、碘也会呈现不同的颜色。故可根据加碘呈现的不同颜色来判断淀粉 的水解程度，从而了解温度、pH对酶促反应速度的影响。淀粉在酶的作用下，逐步降解成的分子量大小不一的中间产物糊精，最后再水解成葡萄糖和麦芽糖；不同的糊精遇碘显不同的颜色。淀粉+淀粉酶味解淀粉糊精 水解紫糊精下解 红糊厂 解消色糊精水解葡萄糖+麦芽糖遇I 2I丨U遇I 2遇I2遇I2遇I2蓝色蓝紫色紫色红褐色无色无色（1）温度对酶活性的影响：由于酶是蛋白质，所以受温度影响，在高温下，酶变性而失去活性；低温下，酶的活性被抑制；适宜温度，酶的活性最强。（这种变性用什么来验证呢？用 不同温度（冰水、40C水浴和沸水浴）作用 淀粉酶，使淀粉部分、

27、完全和不分解后与碘（12）出现的不同颜色来观察。其中， 冰水属低温，酶的活性被抑制，淀粉只能少部分分解，所以遇I2变为紫红色；40C 水浴，酶的活性最强，淀粉完全分解，遇I2变为无色或碘色；沸水浴，酶变性而 失去活性，遇I2变为兰色）（2） pH对酶活性的影响：酶的活性受环境pH的影响极为显著，通常只在一定的pH范围内，酶才表现出活性。植物酶的最适 pH在4.5-6.5之间，而对今天萌发的小麦种子来说，主要起催化作用的酶为淀粉酶，最适pH是5。今天淀粉酶在不同PH （3、5、7）下，使淀粉部分和完全分解后与碘（丨2）出 现的不同颜色来观察。其中，PH为3属强酸性环境，大部分酶已变性失活，淀粉

28、只有一小部分水解，遇I2变为蓝紫色；PH为5属酶的最适PH，酶的活性最强，淀粉完全分解，遇12变为无色或碘色；PH为7属中性环境，酶的活性被部分抑制， 淀粉只有少部分不分解，遇12变为红紫色色（3）酶的催化特异性（专一性）：酶对作用的基质具有严格的选择性，即酶具有专一性。如淀粉酶只能催化淀粉水解，而不能催化蔗糖水解，所以今天我们用淀粉和蔗 糖做底物来验证。即：淀粉+淀粉解葡萄糖+麦芽糖 Cu2+ 生成CU2O砖红色沉淀；蔗糖+淀粉不水解没有CU2O砖红色沉淀生成I温度对酶活性的影响甲组：颜色变化为：紫红色、无色或碘色、蓝色乙组：颜色变化为：无色或碘色、无色或碘色、蓝色 n pH对酶活性的影响颜

29、色变化为：紫红色、无色或碘色、蓝紫色m 酶的催化特异性鉴定：颜色变化：蓝色、蓝色、蓝绿色，说明淀粉酶液中含有 还原性杂质测定：淀粉+淀 完全水解葡萄糖+麦芽糖cU+生成CuO砖红色沉淀；蔗糖+淀粉酶 不水解没有CU2O砖红色沉淀生成）思考题（1）实验中为什么要检验淀粉酶溶液，淀粉溶液或糖溶液 ？16 / 27（2）温度对酶活性有影响，说明酶具有什么性质？实验中如何观察？为说明酶具有易变性。由于酶是蛋白质，所以易受温度影响，在高温下，酶 变性而失去活性；低温下，酶的活性被抑制；适宜温度，酶的活性最强。实验中通过在冰水、40C水浴和沸水浴中淀粉底物的消失情况进行观察，即冰水中，酶 的活性被抑制，淀

30、粉部分分解，遇碘（丨2）显紫红色；沸水浴中，酶变性而失活， 淀粉不分解，遇12变兰色；40 C水浴，酶的活性最大，淀粉完全分解，遇碘不显 色。（3）PH对淀粉酶活性有影响，其最适 PH是多少？实验中如何判断？淀粉酶的最适PH值是5。实验中通过PH为3、5、7检验淀粉酶的最适pH为 5,即pH值为3时，酶的活性丧失，淀粉不分解，遇碘（12）显蓝色；pH值为5 时，酶的活性最大，淀粉完全分解，遇碘不显色；PH值为7时，酶的活性被部分抑制，部分淀粉已分解，遇碘显紫红色。实验2谷物蛋白含量的快速测定一一双缩脲法（P46）在研究植物营养、代谢作用及生长发育等生命活动中，往往需要测定样品中蛋白 质的含量。

31、那么怎样测定呢？用碱性铜溶液。因为肽键在这种溶液中会产生紫色 化合物，其颜色的深浅与肽键的数量成正比，也就是跟 蛋白质含量成正比。颜色 的深浅我们用一种仪器来测定，即用分光光度法测定，以此得出蛋白质的含量。 碱性铜溶液又称为 双缩脲试剂、肽键试剂，所以我们的实验方法就叫 双缩脲法。 原理：在浓碱液中，蛋白质中的肽键（与双缩脲相似的肽键），能与Cu2合， 生成紫色和紫红色化合物，颜色的深浅与蛋白质含量成正比，故可用分光光度法 测定其含量。思考题仃/ 27（1）试验为什么要加无水乙醇（从蛋白质的结构上考虑）、KOH及碳酸铜?答：加无水乙醇的原因：一是做溶剂，使蛋白质溶解出来；二是破坏蛋白质的空间结

32、构使其次级键断裂，让肽键暴露出来，利于反应进行。加KOH的原因：提供强碱条件。加碳酸铜的原因：提供反应所需的Cu2+。注意在实验中：加入碳酸铜 0.5g、无水乙醇10ml、10瘪氧化钾10ml的顺序 不能颠倒。如果先加KOH，再加碳酸铜及无水乙醇、测定的蛋白质含量会降低，这是为什么？（从蛋白质的性质上考虑）一一因为没有无水乙醇的作用，既不能使蛋白 质溶解在其中，也没有破坏蛋白质的空间结构，没有使肽键暴露出来，不利于 反应进行，所以测定的蛋白质含量会降低。（2） 用本组的实验数据计算绝对偏差和相对偏差。（见教材P3的第3点，实验 数据用4个人的，要求写在实验报告上）（3）进行有效数字的计算。（见

33、教材P3的第1点）实验3谷物中可溶性糖的测定蔥酮法（P71）什么是可溶性糖？溶于冷水的可溶性糖包括所有的单糖（如葡萄糖）和寡糖（如 蔗糖），溶于热水的可溶性除所有的单糖（如葡萄糖）和寡糖外，还有部分 多糖（如淀粉和果胶等）。1、为什么测可溶性糖呢？有以下两方面的因素1）糖在植物体内的功能有： 作为能量物质为植物提供能量。如：呼吸作用中糖氧化分解后产生ATP，为植物生长发育和吸收水分、矿物质提供能量。 作为结构物质。如细胞壁的结构物质中就有糖等。 作为原料物质。如呼吸作用中氧化分解的中间产物，为进一步合成脂肪、有机酸、蛋白质提供最初的原料。以前没有大量的肉满足人们的需要，吃的饭 就多，通过吃进去

34、的淀粉水解为糖，糖在分解产生中间产物，在合成蛋白质。 故糖与植物体内各种代谢均有密切关系。2)测糖的意义： 研究植物的代谢。如果生长得快的植株，光合作用形成的糖都用于新器官、新组织的生长发育，而不会在茎杆和叶片中积累。 农产品品质分析的 指标之一。可溶性糖是农产品品质指标和营养指标；如新米中可溶性糖的含量高时，吃起来甜；陈米中含量少，吃起来不甜。2 原理：糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成 蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内(10-100 g),颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的定量分析。由于糖类与蒽酮反应生成的有色物质在可见光区的吸收

35、峰为 620nm,所以在620nm下进行比色， 通过回归方程求得糖的含量。注意事项：1. 将侵提液过滤在烧杯中时，如果烧杯不干燥，先过滤出来的不要，用来润洗烧 杯和移液管。2. 蒽酮一硫酸试剂中含有的是浓 H2SO4，大家一定要小心，不要乱移试剂，摇动 时勿将硫酸溅出来，溅到自己或其他同学身上。思考题(1)植物组织中的可溶性糖包括哪些？溶于冷水的有哪些？植物组织中的可溶性糖包括所有的单糖、 寡糖和部分溶于热水的多糖(淀粉和 果胶);溶于冷水的有所有的单糖和寡糖20 / 27（2）总结分光光度法测定可溶性糖的一般操作程序及注意事项实验4氨基酸的薄层层析一一薄板层析薄层层析亦称薄板层析，是近年来发

36、展起来的一种新型的层析法。因其具有 快速、简易、灵敏度高等许多明显的优点，所以、已经广泛应用于有机化学、生 物学、药物化学等各个领域。原理：根据吸附层析和分配层析两原理将物质分开的。简单的说：根据硅胶 G 对各种氨基酸的吸附能力不同，以及各种氨基酸在水（静相，与硅胶G结合在一起）和有机溶剂（动相，展开剂）中的分配系数不同而达到分离不同氨基酸的目 的。（实验中：硅胶加入水后，通过碾磨，水把硅胶G粘连在一起附着在玻璃板 上，形成一薄层有极性的多孔固体，在有机溶剂（即展开剂）的推动下，由于不 同氨基酸的极性不同，通过硅胶孔隙的速度也不同，而把不同的氨基酸分开。此实验中，丝氨酸是极性氨基酸，被硅胶吸附

37、后跑得最慢，在薄板的最下面；缬氨酸的极性比亮氨酸大，所以缬氨酸在薄板的中间，亮氨酸在最上边）Rf值（比移值）=原点（样品）到层析中心距离原点到溶剂前沿距离思考题（1）薄层层析基本原理是什么？它与纸层析有何不同?薄层层析则是根据吸附层析和分配层析两原理将物质分开的；而纸层析主要是根据分配层析的原理进行的。（2）Rf值的意义是什么？（3）氨基酸的薄层层析中，固定相和流动相分别是什么？固定相是水和 硅胶G,流动相是有机溶剂实验5 PAGE （聚丙烯酰胺）凝胶盘状电泳分离同20 / 27功酶聚丙烯酰胺凝胶电泳同工酶一一凡能催化同一种化学反应，但其分子结构和带电性质不同的一组酶。植物组织中的蛋白质，包括

38、同工酶（isoenzymH都是基因表达的产物。每一 种植物都有相同的遗传信息（DNA ），但其受到严格的控制，与植物的发育阶段和 所处的环境密切相关。植物在不同的发育阶段合成不同的蛋白质（包括酶），所以植物在不同阶段的性状也不同。原理：溶质在电泳的作用下，利用凝胶电泳的浓缩效应，将被分离物质缩成一 狭窄区带，在具有三维网状结构的聚丙烯酰胺凝胶中移动，通过凝胶电泳的电荷 效应和分子筛效应，而将不同同工酶分离。再将电泳后的凝胶置于有H2O2及联苯 胺的溶液中进行染色（利用过氧化物酶催化H2O2水解产生的。2氧化联苯胺成蓝色），而使同工酶带着色，形成不同的同工酶带。（即由于被分离所带电荷数量、分子大

39、小和形状的差异，在电泳时产生不同的泳动速率而相互分离。）思考题（1）简述聚丙烯酰胺凝胶电泳分离同工酶的原理？同工酶定位的原理又是什么？聚丙烯酰胺凝胶电泳分离同工酶的原理 一一溶质在电泳的作用下，利用凝胶电泳的浓缩效应，将被分离物质缩成一狭窄区带，在具有三维网状结构的聚丙烯酰胺凝胶中移动，通过凝胶电泳的电荷效应和分子筛效应， 而将不同同工酶分离。同工酶定位的原理 将电泳后的凝胶置于有 H2O2及联苯胺的溶液中进行 染色（利用过氧化物酶催化 H2O2水解产生的。2氧化联苯胺成蓝色），而使同工酶 带着色，形成不同的同工酶带。(2) 聚丙烯酰胺凝胶电泳可应用于那些方面？(3) 在实验操作过程中，应注意

40、哪些事项？实验6谷物种子赖氨酸含量的快速测定茚三酮法赖氨酸是一种必需氨基酸，对人和动物的生长发育起着重要作用，但通常谷物中赖氨酸含量均较低，特别是玉米籽粒，这一缺陷尤为突出。因此，赖氨酸含 量的高低，已成为谷物品质育种，品种资源鉴定，谷物加工及食品营养等方面的 一项重要指标。本实验用比色法快速测定谷物种子的赖氨酸含量。原理：蛋白质中的赖氨酸(为 R-氨基酸)具有一个游离的£ -NH2，它与水合茚 三酮在弱酸性溶液中一起加热时，生成蓝紫色的化合物，颜色的深浅与赖氨酸含 量成正相关，故可用分光光度计在 530nm的波长下进行比色，读取浓度 C,代入 公式计算赖氨酸的含量。、思考题(1)

41、简述测定谷物样品中赖氨酸含量的意义？答：赖氨酸是碱性氨基酸(一羧基二氨基)，它是人体不能合成的氨基酸，必 须由食物提供，所以称为必需氨基酸。食物中必需氨基酸含量不高，营养价值就 不高；且赖氨酸在人类主食谷物蛋白质中的含量最少(约为0.2%0.4%),因此 它成为营养品质的一个重要指标。故要测定谷物中赖氨酸含量。(2) 在实验过程中应注意那些事项？答：移液要准确；定容时防止样品粘底；过滤时要干滤；移液要准确；加热 时间要足。(3) 测定赖氨酸含量为什么用亮氨酸做标准曲线?答：由于赖氨酸本身有2个NH2，但它在蛋白质中，只有一个£ -NH2可以测 定，所以用C原子数与之相同而分子量比值为

42、1.115的亮氨酸来做标准，进行比 较。实验7硝酸盐含量的测定一一紫外吸收法硝态氮是植物最重要的氮源之一，也是蛋白质合成的原料。植物体内硝态 氮含量可以反映土壤氮素供应情况，因此常作为施肥指标。特别是叶菜类和根菜 类中常含有大量硝酸盐，在烹调和腌制过程中可转化为亚硝酸盐而危害健康。因 此，硝酸盐含量又成为蔬菜及其加工品的重要品质指标。测定植物体内的硝酸盐 含量，不仅能够反映出植物的氮素营养状况，而且对鉴定蔬菜及其加工品的品质 也有重要的意义。原理：利用硝酸根在紫外光区的吸收峰(219nm),测定提取液的消光值，从标 准曲线上可查得相应浓度。提取液需用 pH=9.69.7的氨缓冲液，从待测样品中

43、 提取硝酸根离子，同时加活性炭除去色素，蛋白质沉淀剂除去蛋白质及混浊物， 以得到无色透明溶液。注意事项：(1) NO3的最大吸收波长为200 士 3nm NO的最大吸收波长为210nm实验选择条件219nm处，NO、NO具有等吸收特征。测定结果为 NO和NO之 和，鉴于新鲜蔬菜中NQ含量甚微，可忽略不计。当亚硝酸盐含量高时， 可用其它方法测定NO，而后从总和中扣除。(2) 由于仪器波长差异，测定前可先用标准NO-与NO找出等吸收波长，再进 行测定。思考题(1) 简述紫外分光光度法测定硝酸盐含量的原理？(看前面原理)(2) 紫外分光光度法和可见分光光度法在测定物质含量时有何不同？最大的不同点：一是紫外分光光度法要脱色，而可见分光光度法要显色；二是紫外分光光度法要用石英比色皿比色，而可见分光光度法 用玻璃比色皿比色。（因为紫外光不能透过玻璃）（3）如提取液有色，能否测定出硝酸盐含量？ 不能实验8 酵母RNA的提取和鉴定稀碱法RNA的组成一一RNA是核糖核酸的缩写，它与 DNA （脱氧核糖核酸）的主要 差别是：RNA大多是单链；RNA含核糖而不是含脱氧核糖； 核苷酸中的 四种碱基是嘌呤碱（A腺嘌呤、G 鸟嘌呤）和嘧啶碱（U 尿嘧啶、C 胞嘧