中图版高中生物考点加强课6限制酶的选择原则

1、1.限制酶的选择原则(1) 根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类 应选择切点位于目的基因两端的限制酶， 以便将目的基因“切出”， 如图甲可 选择 Pst。 不能选择切点位于目的基因内部的限制酶， 以防破坏目的基因， 如图甲不能选 择 Sma。 为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接， 也可使用不同的限制酶切割目 的基因和质粒， 如图甲也可选择用 Pst 和 EcoR 两种限制酶 (但要确保质粒上 也有这两种酶的切点 )，而且这种切点不致于破坏所有的“标记基因”以及启动 子和终止子。(2) 根据质粒的特点确定限制酶的种类所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端

2、。 质粒作为载体必须具备标记基因等， 所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结 构，应至少含有一个完好的标记基因，如图乙中限制酶 pst 因其会破坏标记基 因而不宜选择。所选限制酶切点不应位于复制原点处以防破坏复制原点， 如果所选酶的切点不 止一个，则切割重组后可能会丢失某些片段， 若丢失的片段含复制原点区， 则切 割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。 所选限制酶，其切点应位于启动子与终止子之间，如图乙中Hin d会破坏启动子，EcoR会破坏终止子， 而 Nde和 BamH切出的切口可让目的基因嵌入 启动子与终止子之间。(3) 参考 Ti 质粒的 T DNA 片段选择限制酶若质粒上标出 T

3、DNA 片段，则所选限制酶切点应位于 T DNA 片段中，从而 有利于将目的基因嵌入到 TDNA 片段上因为Ti质粒的 TDNA 片段最易 转移至受体细胞并且整合到受体细胞染色体 DNA 上，如用两种限制酶 Xba 和 Sac (两种酶切出的黏性末端不同 )切割某 DNA ，获得含目的基因的片段。 若利 用该片段构建基因表达载体，则下图中甲、乙、丁， Ti 质粒均不宜选择，而丙 Ti 质粒宜选取。 (分析如下 )2.目的基因的检测与鉴定(1) 界定“标记基因”与“ DNA 分子杂交技术”在目的基因检测中的作用： 载体上标记基因的标记原理 载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。 目的基因要

4、转入的受体细胞没 有抵抗相关抗生素的能力。 当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后， 抗性 基因在受体细胞内表达， 使受体细胞能够抵抗相应抗生素， 所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞， 倘若在选择培养基 中不能存活，则表明无质粒转入，当然不会有“目的基因”转入，能存活时必含 该载体，原理如下图所示：“标记基因”筛选后为何还需应用“ DNA 分子杂交技术”确认目的基因是否 转入？ 经上述步骤筛选得到的受体细胞， 只是含特定的标记基因的质粒， 然而，该质粒 上是否成功嵌入了目的基因， 还不能确定， 故仍需使用“目的基因”作探针， 利 用 DNA 分子杂交技术，

5、检测受体细胞的质粒上是否含目的基因。(2) 使用“目的基因”作探针，运用“分子杂交技术”检测目的基因是否转录出 特定 mRNA 。(3) 采用“抗原 抗体杂交技术”， 从转基因生物中提取蛋白质 (作抗原 )与相应抗 体杂交，依据是否出现杂交带确认目的基因是否“指导”特定蛋白质的合成。(4) 采用抗虫、抗病毒等“接种实验”进行目的基因成功表达的“个体生物学” 水平的检测。【例证】 (2016全国卷 ，40)图(a)中的三个 DNA 片段上依次表示出了 EcoR、BamH和 Sau3A三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图 (b)为某种表达 载体的示意图 (载体上的 EcoR、 Sau3A的切点

6、是唯一的 )。根据基因工程的有关知识，回答下列问题：(1) 经 BamH酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被酶切后的产物连接，理由是 (2) 若某人利用图 (b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组 DNA 分子，如图 (c)所示，这三种重组 DNA 分子中，不能在宿主细胞中表达目 的 基 因 产 物 的 有 ， 不 能 表 达 的 原 因 是图(c)(3)DNA 连 接 酶 是 将 两 个DNA 片 段 连 接 起 来 的 酶 ， 常 见 的 有 和 ， 其 中 既 能 连 接 黏 性 末 端 又 能 连 接 平 末 端 的 是 慧眼识图 获取信息 (1) 三种限制酶切割

7、结果分析(2) 表达载体与重组 DNA 分子分析答案 (1)Sau3A 两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端(2) 甲、丙甲中目的基因插入在启动子的上游， 丙中目的基因插入在终止子的下游， 二者的 目的基因均不能被转录 (3)EcoliDNA 连接酶 T4DNA 连接酶 T4DNA 连接酶1. (2019湖南长沙长郡中学月考 )下图是利用工程菌 (大肠杆菌 )生产人生长激素的 实验流程。所用的 pBR322 质粒含有限制酶 Pst 、 EcoR 和 Hind 的切点各 一个，且三种酶切割形成的末端各不相同，而 Ampr 表示氨苄青霉素抗性基因， Tetr 表示四环素抗性基因。请回答以下相关

8、问题：(1) 过程所用到的组织细胞是，过程所用的酶是 。过程常用 溶液处理大肠杆菌。(2) 经过程得到的互补 DNA 片段，称为 。(3) 如果用限制酶 Pst 、 EcoR 和 Hind 对图中质粒进行切割，用一种酶、两 种酶和三种酶分别切割时形成的 DNA 片段种类与用一种酶和两种酶分别切割时 形成的 DNA 片段种类(填“相同”或“不同” )，这些种类的 DNA 片段中含有完整氨苄青霉素抗性基因的 DNA 片段和四环素抗性基因的 DNA 片段分 别有 种和 种。(4) 如果只用限制酶 Pst 切割目的基因和质粒，完成过程、后 (受体大肠杆 菌不含 Ampr、Tetr)，将三角瓶内的大肠杆

9、菌先接种到甲培养基上，形成菌落后 用无菌牙签挑取培养基甲上的单个菌落， 分别接种到乙和丙两个培养基的相同位 置上，一段时间后，菌落的生长状况如图乙、丙所示。接种到甲培养基上的目的 是筛选的大肠杆菌； 接种到培养基乙上的大肠杆菌菌落， 能存活的大肠杆菌体内导入的是 。含有目的基因的大肠杆菌在培养基乙 和丙上的生存情况是 。(5) 将大肠杆菌培养在含氨苄青霉素、四环素培养基上的过程，属于基因工程基 本操作中的 步骤。该基因工程中的 pBR322 质粒彻底水解的产物是 。解析 (1)过程获得的是人生长激素 mRNA ，所以组织细胞取自人垂体组织细 胞；过程 构建基因表达载体的酶是 DNA 连接酶；过

10、程 将基因表达载体导入 大肠杆菌前，常用 CaCl2 溶液处理大肠杆菌， 使之成为感受态细胞。 (2)过程是 人的生长素 mRNA 逆转录形成 cDNA 的过程。 (3)Pst 、 EcoR 和 Hind 三 种酶的切点分别用 1、2、3 表示，一种酶酶切时，一共可以得到 3种相同长度的片段；两种酶酶切时，可得到 12，21，23，32，13，31 六种片段；三种酶酶切时，可得到 12，2 3， 31 三种片段，与前面重复，因此用一种 酶、两种酶和三种酶分别切割时形成的 DNA 片段种类与用一种酶和两种酶分别 切割时形成的 DNA 片段种类相同。这些种类的 DNA 片段中含有完整氨苄青霉 素抗

11、性基因的 DNA 片段和四环素抗性基因的 DNA 片段分别有 3 种和 3种。 (4) 在甲中能生长的是具有四环素抗性的细菌， 含有四环素抗性基因； 在乙培养基中 能生长的是具有四环素和氨苄青霉素抗性的细菌，所以导入的是完整的 pBR322 质粒或含有 Ampr、 Tetr 的质粒。与丙相比，乙培养基中少了两个菌落，说明丙 培养基中这两个菌落中的大肠杆菌成功导入了重组质粒， 而且目的基因插入质粒 后，破坏了氨苄青霉素抗性基因， 使含有目的基因的大肠杆菌不能在含有氨苄青 霉素的乙培养基上生长， 但四环素抗性基因是完好的， 则含有目的基因的大肠杆 菌能在含有四环素的丙培养基上生长。 (5)将大肠杆

12、菌培养在含氨苄青霉素、四环素培养基上的过程， 属于基因工程中的筛选含目的基因的受体细胞步骤。 该基 因工程中的 pBR322 质粒的化学本质是 DNA ，其彻底水解的产物是磷酸、脱氧 核糖和四种含氮碱基。答案 (1)人垂体组织细胞 DNA 连接酶 CaCl2(2)cDNA (3)相同 3 3 (4)含四环素抗性基因 完整的 pBR322 质粒 (或含有 Ampr、Tetr 的质粒 ) 在丙中能存活，在乙中不能存活(5)筛选含目的基因的受体细胞 磷酸、脱氧核糖、四种含氮碱基2. (2019 河南名校联盟调研 )如图所示为培育转基因细菌的操作流程， 回答下列问题：(1) 图中过程所用工具酶有。为了

13、防止载体和外源 DNA 自连，应如何操作？ 。_(2) 当细菌的转化过程中吸收的外源 DNA 是病毒 DNA 时，该转化过程又称转染。 图中外源 DNA 来自 。为了提高转染效率，应使用 处理细菌。(3) 图 中 过 程 ， 重 组 DNA 增 殖 时 需 要 哪 些 条 件 ？(4) 图中过程，筛选含重组质粒的细菌需用到基因的功能。已知所用载体内有青霉素抗性基因和四环素抗性基因两种抗性基因， 请写出能在含四环素 的培养基上生长，但不能在含青霉素的培养基上生长的细菌即为含外源 DNA 细 菌的前提条件： 答_(出两点即可 )。 解析 根据转染的定义可知，培育图示转基因细菌的外源 DNA 应来自

14、 (DNA) 病 毒。另外，限制酶也可以答成限制性核酸内切酶。答案 (1)限制酶和 DNA 连接酶 应使用两种限制酶同时切割载体和外源 DNA (2)(DNA) 病毒 Ca2(3) 模板、原料、酶和能量等(4) 标记 原细菌不具有青霉素和四环素的抗性基因， 外源 DNA 插入到载体的青 霉素抗性基因内部课后加强训练 (时间： 15分钟) 1.(2016全国卷，40)某一质粒载体如图所示，外源 DNA 插入到 Ampr 或 Tetr 中会导致相应的基因失活 (Ampr 表示氨苄青霉素抗性基因， Tetr 表示四环素抗性 基因 )。有人将此质粒载体用 BamH酶切后， 与用 BamH酶切获得的目的

15、基因 混合，加入 DNA 连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结 果大肠杆菌有的未被转化， 有的被转化。 被转化的大肠杆菌有三种， 分别是含有 环状目的基因、 含有质粒载体、 含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。 回 答下列问题：(1) 质 粒 载 体 作 为 基 因 工 程 的 工 具 ， 应 具 备 的 基 本 条 件 有(答出两点即可 )，而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动 子和终止子。(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未 被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是并 且 和 的细 胞 也 是 不能

16、区 分的 ， 其 原 因是。 在上述筛选的基础上， 若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单 菌落，还需使用含有 的固体培养基。 (3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其 DNA 复制所需的原料来 自于。_解析 (1)作为运载体必须具备如下特点： 能自主复制，从而在受体细胞中稳 定保存； 含标记基因，以供重组 DNA 的鉴定和筛选； 具一个至多个限制酶 切割位点以便外源 DNA 插入。(2)在含有氨苄青霉素的培养基上， 只有具有 Ampr 的大肠杆菌才能够生长。而 Ampr 位于质粒上，故未被转化的和仅含环状目的基 因的大肠杆菌细胞中无 Ampr，不能在培养基中生长，而仅

17、含有质粒载体的和含 有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌均具有 Ampr 因而能在培养基中生长。 目的基因的插入破坏了质粒载体的 Tetr，故含有插入了目的基因的重组质粒的大 肠杆菌不能在含有四环素的平板上生长， 从而与仅含有质粒载体的大肠杆菌得以 区分。 (3)噬菌体是病毒，无细胞结构，无法自主合成 DNA ，需借助宿主细胞完 成 DNA 复制答案 (1)能自我复制、具有标记基因 (2)二者均不含有氨芐青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长含有质粒载体含有插入了目的基因的重组质粒 (或答含有重组质粒 ) 二者均含有氨芐青霉素 抗性基因，在该培养基上均能生长 四环素(3) 受体细胞2.(2019

18、 湖北武汉市调研 )人类是乙型肝炎病毒的唯一宿主，现有的肝硬化、肝癌 多从乙肝发展而来， 接种乙肝疫苗是预防乙肝病毒感染的最有效方法。 乙肝疫苗 的研制先后经历了血源性疫苗和基因工程疫苗阶段。 血源性乙肝疫苗是取用乙肝 病毒感染者的血液， 用高速离心法提纯血液中的乙肝病毒， 之后再将其灭活， 制 成乙肝疫苗， 具有一定的感染风险。 如图所示为乙肝基因工程疫苗的生产和使用 过程(注：质粒中 lacZ 基因可使细菌利用培养基中的物质 Xgal，从而使菌落呈 蓝色，若无该基因，则菌落呈白色 )。请回答下列问题：(1)过程最好选用的限制酶方案可以是。A.EcoR 和 BamH B.BamH 和 Eco

19、R C.EcoR 和 EcoR D.只用 BamH (2) 由 图 中 过 程 可 知 ， 该 目 的 基 因 的 具 体 功 能 是(3)若要迅速获取大量的目的基因，以提高重组质粒产生的效率，常用的技术是 (写中文全称 )。图中过程常需要用处理，使大肠杆菌细胞转化为感受态细胞。(4) 为了筛选、获取含重组质粒的大肠杆菌，需在培养大肠杆菌的通用培养基中 额外加入 ，培养一段时间挑选出呈( 填“蓝色”或“白 色” )的菌落进一步培养获得大量目的菌。(5) 用基因工程疫苗接种比血源性疫苗更安全，试从疫苗的结构特点解释原因解析 (1)分析题意可知，切割目的基因和运载体应用相同的限制酶，所用限制 酶要

20、保证目的基因的完整性，并且把目的基因插入质粒中，故选用 BamH 和 EcoR (用一种限制酶切割时， 目的基因和运载体可能会发生自身环化或随意连 接)。 (2)从过程 可知，目的基因在大肠杆菌体内可表达出乙肝病毒外壳，故该 目的基因的功能是指导乙肝病毒外壳蛋白的合成。 (3)获取大量目的基因通常采 用 PCR 技术扩增，即多聚酶链式反应。将目的基因导入大肠杆菌细胞的方法通 常是用 Ca2处理细胞，使其变成易于接受外源 DNA 的感受态细胞。 (4)筛选含 重组质粒的大肠杆菌，可在培养大肠杆菌的通用培养基中加入青霉素和X gal，青霉素可以筛选出转入了含目的基因的重组质粒和正常质粒的大肠杆菌，

21、 由于重 组质粒中 lacZ 基因被破坏，而 lacZ 基因可使细菌利用培养基中的物质 X gal， 使菌落呈蓝色，若无该基因，菌落呈白色，故挑选出白色菌落即可。 (5)研制血 源性疫苗需灭活破坏乙肝病毒的核酸结构， 有可能由于意外因素导致其没有被灭 活，导致乙肝病毒在宿主细胞内大量增殖， 从而使接种者患病， 而基因工程疫苗 不含核酸，其中起作用的是蛋白质，不会引发病毒增殖和感染。答案 (1)B (2)指导合成乙肝病毒外壳蛋白(3)多聚酶链式反应 Ca2 (4)青霉素和 Xgal 白色 (5)研制血源性疫苗需灭活破坏乙肝病毒的核酸结构，灭 活不成功则会导致接种者患病， 而基因工程疫苗不含核酸，

22、 其中起作用的是蛋白 质，不会引发病毒增殖和感染3. (2018 河南名校一联 )胰岛素是治疗糖尿病的重要药物。 现利用基因工程技术让 大肠杆菌生产人胰岛素，下图为大肠杆菌质粒，请据图作答：补充说明： Hind、BamH、EcoR 是限制酶切位点 tetR、ampR是抗生素抗 性基因(1)获取目的基因时，应从人的文库(基因组 /cDNA)中获取，这样做的原因为 。获取后 不能直接对目的基因酶切，因为 ，因此需要在目的基因两端 添加 。(2)天然人胰岛素不耐储存，可使用蛋白质工程对蛋白质进行改造。蛋白质工程 的基本途径为 设计预期蛋白质结构 找到 相对应的脱氧核苷酸序列。答案 (1)cDNA cDNA 中无内含子序列，能够在大肠杆菌中表达正确蛋白质 cDNA 中只有编码氨基酸的序列，直接酶切会导致基因结构改变 BamH 和 EcoR I 的识别位点(2)预期蛋白质功能 推测应有的氨基酸序列4. (2019 河南顶