共聚焦激光扫描显微术

共聚焦激光扫描显微术及其在生物医学中的应用,姚忠祥,一、概述,共聚焦激光扫描显微术(Confocal Laser Scanning Microscopy ,CLSM)特点： 1.显微镜成像 2.激光扫描 3.计算机图象处理,简史: 马文.闵斯基 (Marvin Minsky) 1957 （美国专利） 矛 盾：成像质量、扫描速度 狭缝扫描:成像质量不佳 台阶扫描:光栏不动，移动工作台标本 光束扫描：现通用,二、基本原理,1.光学成像激光器产生的激光经物镜聚焦到样品上反射光或荧光经目镜汇聚于探测器探检测器前有一小孔(Pinhole)汇聚光束,2.成像保存 以电信号形式储存， 可以进行图象分析（参数、伪彩、值等）。3.共轭(confocal) 是指光源孔和检测针孔对物镜焦平面是共轭的。,宽场照明显微镜和共聚焦图象比较,三、CLSM的应用,展现最清晰图象细节,图象处理功能1.光学切片功能：显微CT 微动进步马达最小步距0.1um2.三维图象重建：3D软件 X，Y，Z轴重建，立体旋转,3.荧光物质的定位，定量与动态测量（单标、双标、多重标记）,高速采集,Dronpa蛋白,FRAP光漂白,Folu-EGFP-EB3,Tubulin,Actin,线粒体,4.细胞内PH及Ca,Na等离子定位、双标记组合、OD值与免疫细胞组化、原位杂交技术相结合,细胞生物学功能1.粘附细胞的分选：物理化学特性，细胞亚群2.激光细胞显微外科及光陷阱(optical trap)技术： 激光刀：细胞穿孔、灼烧细胞器、切割染色体、切除神经细胞突起 光陷阱：利用激光的增强效应，钳制或移动细胞器、染色体，进行细胞融合、改建、神经丝去除,3.荧光漂白恢复技术(Fluorescent Redistribution After Photobleaching,FRAP)高浓度脉冲使细胞某一区域荧光淬灭，记录周围非淬灭荧光分子扩散至淬灭区的时间，了解细胞连接的多少、细胞骨架的组装等荧光标记物：CFDAam细胞间通讯连接的影响因素：PH,Ca2+ ,cAMP等,FRAP荧光粹灭漂白恢复法 举例,荧光染料：二乙基羧化荧光素 (carboxyfluorescein diacetate，CFDA)标本：大鼠膀胱逼尿肌细胞（细胞培养）分组：实验组，可见荧光恢复现象 干预组（加GJ阻断剂），无荧光恢复现象观察时间：光漂白后0，2，4分钟,A,B,C,D,A,B,C,D,4、膜流动性的测定细胞膜荧光探针受到极化光的刺激激化后，发射光的极性依赖于荧光分子的旋转，而这种有序的运动自由度依赖于荧光分子周围膜流动性，故极性测量可以反映膜的流动性,5.光活化技术或称光笼锁（caged）化合物技术 笼锁化合物又称光致不稳定笼锁化合物(Photolabile caged compounds)，通过基团修饰以掩蔽生物活性分子，使其以惰性前体形式存在。通常是可逆的。原理：紫外线照射共价键断裂释放生物活性分子,笼锁化合物的两种光化学反应原理： 偶氮苯的光致同分异构作用和硝基甲苯的光致分解作用,1.偶氮苯衍生物：偶氮苯衍生物具有顺式和反式立体同分异构体，其药理性质不同，并可用不同波长光照以控制两种同分异构体间的转化。早在经典的笼锁化合物问世以前，已有乙酰胆碱激动剂与偶氮苯结合生成光敏物质Bis-Q。Bis-Q顺式无活性，用420-440nm光照后即转化成反式而激活，再经过340nm光照后又变成顺式。Bio-Q与电生理技术结合用于研究电鳗和电鳐的乙酰胆碱受体。,2.邻硝基甲苯衍生物：目前应用最广泛的笼锁化合物系利用硝基甲苯的光敏性质合成。当生物活性分子与硝基甲苯结合即暂时失活，故又将后者称为掩蔽基团或笼锁基团。一旦受到光照，连接于侧链碳原子的前体即解离而释放出活性分子、质子和亚硝基副产物。,笼锁神经递质、调质及抗体 例：光照解笼锁 NPE-氨甲酰胆碱血管平滑肌收缩（氨甲酰释放）Caged入Cell途径：诱入法，酯化法，电极导入法，膜片钳全细胞方式导入法,CLSM的优点,1.激光是单色光、LM观察、荧光观察2.推进器步距达0.1um（“显微CT”）3.图象以电信号形式记录、储存，可修饰伪彩、测定细胞参数，直接获得图象4.图形经精细调焦的光束成像，清晰度高5.可活体观察、动态观察,四、CLSM 使用步骤,（一）样品准备培养细胞，如用钙Fluo-3可用市售培养皿紫外激发，Fluo-2,0.2um盖玻片制成培养瓶底活组织切片：甘油封片，无自发荧光,（二） 选择荧光探针1000余种钙：Fluo-3/am(水溶性)不用紫外光激发，可渗透细胞。Fluo-2用紫外激发，不穿透，需用Microinjection观察细胞内PH：Snarf荧光素中插入萘而合成，可与Fluo-3或Fluo-2联合测定细胞内钙与PH,CLSM常用荧光探针,细胞内钙：Fluo-3,Rhod-1,Indo-1,Fura-2DNA & RNA:碘化丙锭PI,吖啶橙AO膜电位：DiBAC4PH值：SNARF类，疏水性探针用Am形式细胞间通讯：6-carboxyfluorescent diacetate,6-CFDA细胞内活性氧；H2DCFDAImmunocytochemistry multipole staining,DNA chip：Cy3,Cy5,CY3 redCY5 Green,Living dye-Green Fluorescence protein(GFP),下村脩(Osamu Shimomura)1962年从一种水母身上分离出绿色荧光蛋白(GFP),绿色荧光蛋白GFP分子结构图,GFP是一种由238个氨基酸构成的柱状蛋白。外围由折叠片围绕，内部则是一个线状的-螺旋通过其长轴从中间穿过。,Douglas Prasher 1992年克隆出了GFP基因,当GFP受紫外光或蓝光激发时，-螺旋包含的发色团会发出绿色荧光。由于这一特点及其无种属限制，GFP作为荧光标签被广泛用于细胞水平上的监测生物活动。,2008诺贝尔化学奖由下村脩(Osamu Shimomura)、Martin Chalfie 和钱永健 (Roger Tsien)三人分享，代表了绿色荧光蛋白研究上的三个里程碑,在GFP基因上突变几个不同的位点形成增强型绿色荧光蛋白(enhanced GFP,EGFP),黄色（EYFP）, 黄绿色（ECFP）和兰色（EBFP）的活体荧光蛋白。这些荧光蛋白都具有稳定、无细胞毒性、灵敏度高,不需反应基质（substrate）等优点,又称为单标记系统（single tag system）。,The Discovery of Aequorin and GFP,标记CFP和GFP的脑皮质神经元,小鼠脑部邻近神经元可以随机表达不同颜色的GFP(称之为XFPs),转染pEGFP载体后24h可见神经干细胞集落内有少量GFP阳性细胞。(荧光+普通光相差显微镜100倍),加血清48h后，神经干细胞集落内和周边均有GFP阳性细胞。(荧光普通光相差显微镜，荧光相差显微镜400倍),最重要是能用于活细胞和蛋白质进行实时定位和观察，不需特殊的激发光谱，故又将此组荧光蛋白称为自动荧光蛋白(autofluorescent proteins,AFPs)。红色荧光蛋白(RFP)是从海产的IndoPacific sea anemone relative Discoma Striiata 中分离的一种独特的显示红色荧光的蛋白质，故又名为DsRed。,1.神经细胞参数测定及三维重建细胞外形 浦肯野氏细胞及其突起的投射神经细胞轴突走向及神经支配的研究神经骨架重组的研究,五、在神经生物学的应用,2.神经递质、调质及细胞内活性物质受体的荧光定位3.细胞内钙离子的测定细胞内信号传导的研究钙内流与神经递质释放的关系微环境变化，受体激活，电刺激与钙的释放4.细胞内PH值的测定，脑缺血，损伤时细胞内PH变化,5.荧光漂白恢复技术(FRAP)与细胞间通讯研究Gap junction的分布，密度，调控因素，网络阻断剂(Othanol , Dieldrin)6.激光手术切除神经细胞突起光陷阱技术，套除细胞器，移动染色体7.神经细胞编程性死亡(programmed cell death,PCD)与细胞内钙的关系与细胞内PH的关系,划痕负载法计算公式,红色：大分子RB200绿色：小分子Lufic YELLOWRB200只可通过划痕处损伤细胞膜进入Lyellow可通过划痕及Gap