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上海海洋大学硕士学位论文 低聚羧甲基壳聚糖的抗氧化性能研究 摘要 甲壳素壳聚糖是一种及其重要的海洋多糖。由于其良好的生物相容性、可生 物降解性。无毒以及独特的物化性质和生理活性，甲壳素壳聚糖的研究在世界范 围内掀起了研究热潮。甲壳素壳聚糖及其衍生物在医药。食品、化工和农业等各 方面都展示其巨大的应用潜力。其相关的理论研究和应用探索将对糖生物学、糖 工程以及海洋药物的发展和产业化产生深刻的影响， 本文首先从糖生物学、糖工程以及海洋药物的发展的角度阐述了甲壳素壳聚 糖这一眼就领域的重要意义。然后对甲壳素壳聚糖羧甲基壳聚糖化学进行了详细 的综述，最后在这一领域的研究热点壳聚糖衍生物抗氧化活性方面进行了一 些初步的探索研究。本文采用醚化对低聚壳聚糖进行了化学改性，获得了一系列 不同取代位点和取代度的羧甲基壳聚糖，详细研究了其抗氧化活性，并首次报道 了取代位点和取代度对羧甲基壳聚糖抗氧化活性的影响规律。 本文利用氯乙酸和壳聚糖在碱性条件下加热反应得到了n ，o 羧甲基壳聚糖； 室温羧甲基化得到o 羧甲基壳聚糖；采用乙醛酸为羧甲基化试剂，经硼氢化钠还 原制备了n 羧甲基壳聚糖。对其结构进行了红外表征，并采用电位滴定法计算其 取代度，并考察了羧甲基壳聚糖对超氧阴离子自由基0 2 。、d p p h 自由基和过氧化 氢h 2 0 2 的清除活性以及还原能力。主要结论如下： 1 随着o h 取代度的降低，n ，o 羧甲基壳聚糖清除超氧阴离子和d p p h 自由 基的活性增强；随着n h 2 取代度的降低，n ，o 一羧甲基壳聚糖清除h 2 0 2 的活性增强； 随着总取代度的增大，n ，0 羧甲基壳聚糖的还原能力提高。 2 随着取代度的增加，o 羧甲基壳聚糖清除超氧阴离子的活性增强；而清除 过氧化氢的活性以及还原能力的强弱顺序为：o b o a o c ，其中取代度为o 3 8 的o b 表现出最强的活性。 3 随着取代度的增加，n 羧甲基壳聚糖清除d p p h 自由基的活性降低，还原能 力增强。而清除超氧阴离子的活性强弱顺序为：n b n c n a ，其中取代度为o 4 1 的n b 表现出最强的活性。 4 低聚壳聚糖c o s 及其相同取代度( 0 5 4 ) 的o 羧甲基壳聚糖和n 羧甲基壳 聚糖清除超氧阴离子的活性及还原能力大小顺序为：o c m c o s c o s i 上海海洋火学硕士学位论文 n c m c o s 。这一结果表明活性氨基在壳聚糖及其衍生物的抗氧化性能中意义重 大。 本文揭示了取代位点和取代度对羧甲基壳聚糖抗氧化活性的影响规律，探讨 了其清除自由基的作用机制，为壳聚糖及其衍生物抗氧化机理的深入研究和天然 抗氧化剂的开发利用提供了相关依据和思路。 关键词壳聚糖，羧甲基壳聚糖，抗氧化，取代度 a n t i o x i d a n ta c t i v i t i e so fc a r b o x y m e t h y lc h i t o s a n o l i g o s a c c h a r i d e s a bs t r a c t c h i t i n c h i t o s a ni so n eo ft h em o s ti m p o r t a n tm a r i n ep o l y s a c c h a r i d e s c h i t i na n d c h i t o s a nh a v ea 竹r a c t e dm o s ta t t e n t i o ni nt h ew o r l dd u et ot h e i rg o o db i o c o m p a t i b i l i t y ， d e g r a d a b i l i t y ，l o wt o x i ca n ds p e c i a lp h y s i c o c h e m i c a lp r o p e r t i e sa n d b i o l o g i c a la c t i v i t i e s t h e vh a v ep r o s p e c t i v ea p p l i c a t i o n si nm a n yf i e l d s s u c ha sb i o m e d i c i n e ，c h e m i c a l i n d u s t r y ，l i g h ti n d u s t r y ，a n da g r i c u l t u r e t h er e s e a r c h o nt h e o r ya n da p p l i c a t i o no f c h i t i n c h i t o s a i lw i l lh a v eg r e a t e l e c to nt h ed e v e l o p m e n t o f g l y c o b i o l o g y ， g l y c o t e c h n o l o g y ，a n dm a r i n ed r u g i nt h i sp a p e r , c a r b o x y m e t h y lc h i t o s a no l i g o s a c c h a r i d e sw i t hd i f f e r e n tp o s i t i o n sa n d d e g r e e so fs u b s t i t u t i o n ( d s s ) w e r ep r e p a r e d b yt h e e t h e r i f i c a t i o no fc h i t o s a n o l i g o s a c c h a r i d e t h e i r a n t i o x i d a n ta c t i v i t i e sw e r es t u d i e dp a r t i c u l a r l y a n dt h e r e l a t i o n s h i db e t w e e l lt h ep r o p e r t i e so fc a r b o x y m e t h y lc h i t o s a no l i g o s a c c h r i d e s a n dt h e i r a n t i o x i d a n ta c t i v i t i e sw a sf i r s tr e p o r t e d n o c a r b o x y m e t h y lc h i t o s a no l i g o s a c c h a r i d e s ( n ，o c m c o s s ) w e r e o b t a i n e d w i mc h l o r o a c “ca c i da n dc h i t o s a no l i g o s a c c h a r i d e s ( c o s ) i na l k a l i n e a n dh e a t i n g c o n d i t i o n a tr o o mt e m p e r a t u r e ，o c a r b o x y m e t h y l c h i t o s a n o l i g o s a c c h a r i d e s ( o c m c o s s ) w e r ep r e p a r e dw i t h c h l o r o a c e t i ca c i d a n dc o si na l k a l i n e n - c a r b o x y m e t h y lc h i t o s a no l i g o s a c c h a r i d e s ( n c m c o s s ) w e r es y n t h e s i z e db yt w os t e p s ： f i r s t l y ，c o sr e a c t e dw i t hg l y o x y l i ca c i d ，t h e n ，d e o x i d i z e db ys o d i u mb o r o h y d r i d e t h e i r s 仃u c t n r e sw e r ec h a r a c t e r i z e db yf t i ra n dd s sw e r em e a s u r e db yp ht i t r a t i o n i n a d d i f i o n t h e i ra n t i o x i d a n ta c t i v i t i e sw e r ee v a l u a t e db yt h es c a v e n g i n go fs u p e r o x i d e a n i o n ( 0 2 。) ，i , i d i p h e n y l 2 一p i c r y l h r a z y l r a d i c a l ( d p p h ) ，h y d r o g e np e r o x i d e ( h 2 0 2 ) a n dd e t e r m i n a t i o no fr e d u c i n gp o w e r t h em a i nr e s u l t sa r es h o w n a sf o l l o w i n g ： 1 t h es c a v e n g i n ge f f e c t so fn ，0 一c m c o s st o w a r d s0 2 a n dd p p hi n c r e a s e dw i t h i l t 上海海洋大学硕士学位论文 t h ed e c r e a s i n go fd s so f - o hp o s i t i o n m o r e o v e r , t h ei n h i b i t i n ge f f i c a c yi nh 2 0 2 s y s t e m i n c r e a s e dw i t ht h ed e c r e a s i n go fd s so f n h 2p o s i t i o nw h e r e a st h e i rr e d u c i n gp o w e r i n c r e a s e dw i t ht h ei n c r e a s i n go ft h et o t a ld s s 2 t h es c a v e n g i n ge f f e c to fo c m c o s so n0 2 i n c r e a s e dw i t ht h ei n c r e a s i n go f d s ，w h e r e a st h eo r d e r so ft h e i ri n h i b i t i n ge f f i c a c yo nh y d r o g e np e r o x i d ea n dr e d u c i n g p o w e rw e r e ：o b o a o c 3 w i t ht h ei n c r e a s i n go f s u b s t i t u t i n gd e g r e e ，t h es c a v e n g i n ga c t i v i t yo f n _ c m c o s sa g a i n s td p p hr a d i c a ld e c r e a s e d a sf o r0 2 s c a v e n g i n g ，t h eo r d e ri s n b n c n a 。 4 t h ea n t i o x i d a n ta c t i v i t i e so fo c m c o sa n dn c m c o sw i t ht h es a m e d e g r e eo f s u b s t i t u t i o n ( 0 5 4 ) w e r ee v a l u a t e d t h es c a v e n g i n go r d e ra g a i n s t0 2 a n dr e d u c i n g p o w e ro r d e ro fc o sa n di t sd e f t v a t i v e sw a s ：o c m c o s c o s n c m c o s t h e r e s u l ti n d i c a t e dt h a ta m i n o g r o u pt o o kv e r yi m p o r t a n tp a r ti nt h ea n t i o x i d a n ta c t i v i t i e so f c o sa n di t sd e f t v a t i v e s i nt h i sp a p e r , t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h ep r o p e r t i e so fc a r b o x y m e t h y lc h i t o s a n o l i g o s a c c h r i d e sa n dt h e i ra n t i o x i d a n ta c t i v i t i e sw a sf i r s tr e p o r t e d i na d d i t i o n ，t h e i r d i f f e r e n tr a d i c a ls c a v e n g i n gm e c h a n i s m sw e r ed i s c u s s e d k e yw o r d s c h i t o s a n ，c a r b o x y m e t h y lc h i t o s a n ，a n t i o x i d a n ta c t i v i t y ，s u b s t i t u t i n g d e g r e e i v 上海海洋大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位 论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除 文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集 体己经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我 对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：均占扁 日期：矽卵年，月，乡日 上海海洋大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密 口 ，在年解密后适用本版权书。 本学位论文属于， 不保密囱 学位论文作者签名：_ bf 名 日期：刃哆年月哆日 指剥币虢占小为 日期：砌哆年f 月多日 上海海洋火学硕士学位论文 第一章引言 糖类化合物结构复杂，糖链中的糖苷键的连接方式比蛋白质中的肽键和核酸 中的磷脂键要复杂得多，因此糖键中所蕴含的生物信息量远远超过蛋白质和核酸。 糖在生命过程中不仅仅能充当细胞的能量来源和细胞骨架，更为重要的是可作为 细胞识别的主要标记物、细胞信息传递物质和细胞的“天线”。目前的研究己确认糖 链参与生物体受精、发育、分化、免疫和神经系统的识别与调控。在微生物与动 植物的相互作用中担负着重要作用，同时也涉及老化和癌症等过程。 八十年代兴起的蛋白质工程和核酸的研究揭示了蛋白质和核酸在生命过程中 的重要作用。但越来越多的研究表明：很多生理过程中，蛋白质的蛋白仅仅起载 体的作用，其生物功能的强弱甚至有无其多糖侧链密切相关。对生命奥秘的探索， 促使人类对糖类的那就产生了浓厚的兴趣。随着分子生物学的飞速发展，现代分 子生物学理论和研究技术日趋成熟，由核酸和蛋白质开始的关于生物大分子结构 与功能的研究己扩展到生物膜的蛋白质，并向多糖类与脂类的结构与功能延伸。 由此促成了新型学科一糖生物学和糖工程的形成和飞速发展，并将成为二十一世 纪的重大科学前沿之一【1 。1 。 糖生物学是以生物大分子组成部分寡糖链或寡糖本身为对象，以糖化学、免 疫学及分子生物学等学科为基础，研究寡糖链作为“生物信息分子”在多细胞的高层 次生命中的功能的学科。它是九十年代发展起来的生物化学中的最后一个巨大前 沿。研究糖生物学的方法论和基本技术，以及把基础研究获得的知识进一步转化 为生产技术，则成为糖工程。目前国际上主要是美国、日本和欧洲国家对糖生物 学和糖工程研究非常重视，近几年进展非常快。糖生物学的研究手段涉及现代分 析化学、分子生物学、免疫学、神经科学、发展生物学等等学科，其发展必将推 动这些学科的发展。 生物体内的多糖主要分为两大部分。一部分作为信息分子，种类多，每种含 量少，结构复杂，信息量大。另一部分作为细胞和细胞外间质的重要构成成分， 种类少，结构规整庞大。作为信息分子的多糖，其主要功能为：以其糖链序列 特征作为生物识别的标志；维持和保护蛋白质的结构与构象，抗蛋白酶水解， 参与溶解度【1 2 】；免疫系统中参与活化补体，淋巴因子间及与免疫细胞间的相互 作用，免疫细胞对肿瘤细胞及病毒细菌的杀伤【1 3 】；参与细胞的分化和生长。而 作为细胞和细胞外间质主要成分多糖，可以主动参与和影响细胞的各种行为，与 组织的形成、细胞的分化、移动、细胞间信息的交流、功能的发挥有着密切的关 】 上海海洋大学硕七学位论文 系【1 4 j 。 当机体自身免疫系统或细胞脱轨出现自身免疫疾病或癌症时，细胞表面的糖 分子会改变结构和组成，出现异常糖基化和异常细胞代谢。在机体衰老过程中， 糖链合成受累，糖链减短，密度变稀。由此可见多糖与许多疾病病理过程以及衰 老过程密切相关。寻找治疗上的多糖先导化合物加以改造和合成己成为当今医药 界的热点。多糖药物的作用位点是细胞表面，其特点是可作用于病理过程的第一 步，而且不进入细胞，是副作用相对最小的药物。多糖药物来源广泛，大多数是 天然存在的化合物。多糖药物的发展趋势之一是开辟广泛的糖药物来源。我国“中 药现代化”和“向海洋要药”的战略莫不基于这一点。 海洋药物的开发是现代海洋生物技术的中药内容。美、日、法、英、俄等国 家都投入巨资发展海洋药物。我国也把发展海洋药物的主攻方向定为海洋生物活 性物质的研究和新的海洋生物医用材料的开发等五个方面。我国海域辽阔，海洋 资源丰富而有特色，海洋药物的研究将成为二十一世纪我国药学研究的新热点 1 5 - 1 7 。目前，国内外海洋药物的研究方法主要是：从海洋生物分离出生物活性物 质，进行结构鉴定，研究其生物合成途径，以期实现人工全合成。考虑到海洋生 物资源量的有限性以及海洋活性物质含量低微，上述研究思路对产业化开发几乎 无能为力。 海洋多糖是海洋药物的重要来源。对海洋多糖进行分子修饰，改变其结构， 可提高其生物活性，赋予其新的功能，并降低其毒副作用【1 8 】。海洋多糖种类繁多， 且结构具有复杂性和多样性，对其进行分子修饰可获得各种结构类型和各种生物 活性的多糖衍生物，为多糖构效关系分析奠定基础，为多糖药物的设计、研究和 开发提供理论支持。作为海洋生物的结构组分，海洋多糖大多数具有来源广泛和 含量丰富的优点。通过化学修饰来获得具有多种生物功能的海洋多糖药物的方法 可以为海洋药物的产业化提供一种全新的思路，有利于促进我国海洋多糖药物的 发展。 甲壳素是广泛存在而又极其重要的一类海洋多糖，被誉为“第六生命要素”，有 种说法甚至把二十一世纪称为“甲壳素世纪”。近年来，甲壳素及其脱乙酰产物壳聚 糖的研究与应用在全球范围内已形成高潮【1 9 - 3 0 1 。这也可以从近年来c a 和s c i 中 有关甲壳素和壳聚糖的文献数呈不断增长的趋势中看出。 2 上海海洋大学硕士学位论文 第二章甲壳素壳聚糖羧甲基壳聚糖概论 2 1 概述 甲壳素( c h i t i n ) 广泛存在于昆虫和甲壳类动物( 如虾、蟹等) 的硬壳及真菌 的细胞壁中，是继纤维素之后，地球上蕴藏量最丰富的天然有机物3 1 1 。其结构式 如下： c 1 i t i n 私 自从上世纪6 0 年代以来，甲壳素及其衍生物的研究十分活跃。甲壳素又称甲 壳质、壳质、几丁质，是一种带正电荷的天然多糖高聚物，是由2 乙酰氨基2 脱 氧d 葡萄糖通过1 3 - ( 1 4 ) 糖苷键连接起来的直链糖。壳聚糖( c h i t o s a n ) 是甲壳 质大分子脱去乙酰基后的产物，结构见下图： 壳聚糖是白色或淡黄色片状固体。不溶于水、乙醇和丙酮，能溶于无机酸和 水杨酸、酒石酸及抗坏血酸等有机酸，也能溶于许多稀酸溶液中【3 2 1 。壳聚糖具有 良好的生物相容性，无免疫原性，无毒无味，可生物降解等特点。甲壳素和壳聚 3u 上海海洋大学硕士学位论文 糖在医药和卫生材料方面的应用研究由来己久，有些研究成果已付诸实际应用， 甚至已经工业化生产。随着产业化的实施其临床应用的范围不断拓宽，既有不直 接与人体接触的，也有与人体组织接触的：既有做成药物使用，也有作药物载体；既 有用于治疗的，也有用于保健的。其中以人工皮肤和外科手术缝合线最引人瞩目， 展现了诱人的应用前景。特别要看到由于壳聚糖具有优良的生物相容性和生物可 降解性，是理想的细胞外基质材料，从而使壳聚糖及其衍生物被广泛地应用于生 物医学领域【3 3 1 。目前已利用壳聚糖成功地开发出人工皮肤、人工肾的透析膜等产 品；在作为神经、肌腱、骨骼、牙齿等组织器官的修复材料和作为培养肝脏、肾 脏等实质器官细胞的支架材料的研究中展现出广泛的应用前景【34 1 。 与甲壳素相比，脱去部分乙酰基的壳聚糖溶解性能已有很大程度的改善，但 也只能溶解在稀酸性溶液，这在很大程度上限制了其推广应用，因此改善壳聚糖 的溶解性能，特别是改善其水溶性，是壳聚糖改性研究中最重要的方向之一。在 众多改性方法中，水溶性羧甲基壳聚糖的研究较早，也是最引人注目的课题之一。 羧甲基壳聚糖在日化、食品、造纸、制药、化妆品等方面都有着重要的用途，这 主要是因为羧甲基壳聚糖具有如下优良性能【3 5 】： ( 1 ) 水溶性。取代度大于0 6 的羧甲基壳聚糖易溶于水，取代度愈高，水溶性愈 好，其溶液的透明度也愈好。 ( 2 ) 保湿性。羧甲基壳聚糖上的羧基及氨基都是亲水基团，有着较强的吸水性， 0 2 5 的羧甲基壳聚糖溶液的吸湿度与2 0 的丙三醇相当，溶液的粘度恒定。 ( 3 ) 成膜性。羧甲基壳聚糖有较好的成膜性，其膜具有光泽，透明而柔韧，并 有较好的透气性。 ( 4 ) 高分子性能。对胶体有稳定作用，有增稠及凝胶的作用和气泡稳定作用。 ( 5 ) 生物学性能。羧甲基壳聚糖生物学性能优异，安全、无毒、无害。 2 2 羧甲基壳聚糖的分类与制备 壳聚糖的化学改性的主要类型有以下几种：酰化、醚化、n 烷基化、酯化等。 在众多的化学改性，醚化反应之一的羧甲基化是研究比较多的种。羧甲基壳聚 搪( c a r b o x y m e t h y lc h i t o s a n ，c m c ) 是壳聚搪经羧甲基化反应后的一类壳聚糖衍生 物。由于壳聚糖分子中存在游离氨基和羟基，反应时取代基可进入o ( c 6 ) 和n ( c 2 ) 。 则相应的产物有o 羧甲基壳聚糖( o c m c ) 、n 羧甲基壳聚糖( n c m c ) 和n ，o - 羧甲 基壳聚搪，o c m c ) 。 4 上海海洋大学硕士学何论文 2 2 1o c m c f l , * j $ 1 备 o c m c 一般是在碱性和低温条件下，壳聚糖的c 6 i 刍轻基与一氯乙酸发生反应 而制得的。这种制备方法是m u z z a r e l l i 等人 3 6 】首先提出来的：用氢氧化钠溶液( 4 2 ) 浸渍过的甲壳素，与一氯乙酸钠低温3 0 进行羧甲基化反应5 小时，得n o c m c 。 也有人利用壳聚糖为原料，通过不同的工艺方法制备出o - c m c 。例如，陈鲁 生、李嘉林等【37 1 ，将壳聚糖粉碎到一定细度以下，浸泡在氢氧化钠溶液中数小时 后挤压成滤饼状，然后加入一定量氯乙酸与异丙醇棍合溶液，室温下搅拌数小时， 除溶剂，j n - 次水，用盐酸溶液调节p h 值，加乙醉，离心，烘干得到粗产品。粗 产品粉碎至1 5m m 后，用氢氧化钠溶液浸泡一段时间后，与氯乙酸反应8 小时，所 得产率较高，可达8 0 以上。邵健等【3 8 】取一定量壳聚糖溶于乙酸溶液中，抽滤除 去不溶物，搅拌下滴加氢氧化钠溶液至一定p h ，抽滤，将沉淀加入氢氧化钠溶液 匀浆，得悬浊液冷冻过夜。解冻后，加入氯乙酸和乙醇溶液，反应5 d , 时后，经过 精制得o c m c 。李治等【3 9 】取壳聚糖粉末，悬浮于一定浓度的氢氧化钠溶液中，加 入氯乙酸与冰醋酸混合液，在一定温度下反应，每隔一段时间，加入氯乙酸钠与 冰醋酸的混合液，搅拌反应数小时，然后用盐酸溶液调节p h 值，静置，取下层沉 淀，用去离子水洗涤，烘干，得o c m c ，羧甲基化最高可达8 0 。 2 2 2n - c m c 的制备 n c m c 通常是在酸性介质中进行，采用乙醛酸作为羧甲基化试剂，通过壳聚 糖上的自由氨基与乙醛酸的反应，生成可溶性的醛亚胺，然后用适当的还原剂还 原产物制得的。第一步反应是在均相体系进行因而非常容易制各，而且反应常温 下就能进行。反应生成的n c m c 含有乙酰基、羧甲基和自由氨基基团，其比例取 决于壳聚糖的选择( 脱乙酰度及摩尔质量) 以及乙醛酸所用的量。所选用的原料壳聚 糖来源不同，制得的n c m c 水溶性差别较大m 】。该反应的特点是取代有选择性， 不需要加热，可在水溶液中进行，为均相体系。 在上述方法基础上，有人通过先加冰醋酸溶解原料，后加入乙醛酸进行反应。 m u z z a r e l l i 掣3 6 】将壳聚糖粉末( 7g ) 悬浮于一定量的去离子水( 4 8 2m l ) o ? ，在2 0 温 度下加冰醋酸( 4 6 5g ) 促进溶解，再加入5 8g z , 醛酸溶液( 5 0 浓度) 搅拌一段时间， 使壳聚糖溶液中含有等比例乙醛酸和氨基，用氢氧化钠调节p h 值至4 0 0 。加入硼 氰化钠后p h 值达到4 8 。将所得的清澈粘性溶液用去离子水透析，得到n c m c 。 2 2 3n o c m c 的制备 目前，c m c 的制备方法中，以n ，o c m c 的制备最为普遍。因为n ，o c m c i 拘 5 上海海洋大学硕士学位论文 制备方法相对简便且原料易得。一般，n ，o c m c 是通过壳聚糖在浓碱液中与氯乙 酸反应，适当控制反应条件得到的。由于反应是非均相反应，收率和取代度以及 反应的均匀性都不理想，科研工作者采用了各种不同措施对原有工艺进行了改进。 按h a y e s 等【4 1 】的专利，碱液在低温溶胀阶段己全部加入，随即进行羧甲基化， 这属于一次加碱反应，取代度在0 4 0 8 之间，氯乙酸利用率低。 陈忻等 4 2 将壳聚糖溶于稀乙酸，用过量的丙酮沉淀得壳聚糖乙酸盐后，加入 一定量的氢氧化钠溶液和异丙醇，控制壳聚糖与氯乙酸反应温度和时间，得粗产 品；产物调p h 值至中性，用8 5 的甲醇洗涤，干燥得产品。 吴国杰等【4 3 】在异丙醇中加入壳聚糖，将氢氧化钠水溶液分成若干等份，每隔 一定时间加入一份，在所得的碱液中分数次加入一氯乙酸，一定温度下，反应数 小时后精制n ，o c m c ，其水溶液具有很好的透明度。 于兹东等 将壳聚糖在乙醇中浸泡并用5 0 氢氧化钠碱化，制得碱化壳聚糖。 然后加入氯乙酸在一定温度范围内搅拌反应数小时得粗产品，用乙醇提纯得到白 色片状c m c 。 张芝芬等【4 5 】对壳聚糖粉碎处理后，加一定量异丙醇，在一定温度下加入适量 氢氧化钠，搅拌一段时间，再加入氧乙酸，在一定温度下保温使其充分反应，然 后精制获得成品，由于采用了正交试验中对n ，o 羧甲基壳聚糖进行制备条件的优 化组合，所获得产品的羧甲基化程度较高，水溶性好，具有较高的开发利用价值。 2 3 羧甲基壳聚糖的功能性质及应用 2 3 1 医学上的应用 羧甲基壳聚糖可用于伤口贴、包扎带、人造骨骼和人造皮肤以及固定化酶和 药物传递释放系统。利用c m c 易于阻止组织间粘结的性质，可将其凝胶或膜做成 伤口贴、包扎带用于外科伤口，由于c m c 形成的凝胶粘度和弹性大于血浆，可阻 止血液在组织表面凝结从而阻止粘结【4 引。 c m c 具有抑菌杀菌功能，口服羧甲基壳聚糖具有促进肠内共生有益菌群的繁 殖如双歧杆菌的繁殖，抑制有害菌的生存，提高身体免疫力，有显著的降血脂及 胆固醇的作用，并能清除机体内的铅、汞。不同取代位置的羧甲基壳聚糖，其抗 菌性方面各有其独特的一面。例如，取代度1 0 以上的n ，o c m c 进行了体外抑菌试 验，证实了分子量低于5 0 0 0 的n ，o c m c 的抑菌活性较强，该样品对金黄色葡萄球 菌等细菌具有抑菌杀灭作用【4 7 1 。o c m c 也具有一定的抗菌性能，其抗菌性随羧甲 6 上海海洋大学硕士学位论文 基度升高呈先升后降的规律。与壳聚糖相比，表现出相当强的抗菌性能【4 引。 0 c m c 还可作为固定酶的载体，如固定d 葡萄糖异构酶，溶菌酶等。若将可 防治癌细胞生长的天门冬酰胺酶固定上去，有可能成为医治白血病的新型药物【4 9 1 。 利用n ，0 c m c 与亚铁离子络合的基本特性，可以用于治疗缺铁性贫血，因为 人体对c m c 壳聚搪亚铁络合物的吸收远远大于传统的f e s 0 4 药物，这方面的研究 以期为开发天然生物补铁制剂开辟新途径【5 。 2 3 2 食品工业上的应用 在食品工业中羧甲基甲壳素可作保鲜剂，0 c m c 与植酸复配，添加适量的 亚硫酸钠，对荔枝或水产品的防褐色突变具有明显效果。 n ，0 c m c 水溶液形成的薄膜对气体有选择性的通透，特别适合于作为水果保 鲜剂。美国和加拿大有一种商品名为 n u t r i s a v e 的n ，0 c m c 水果保鲜剂即将上市。 国内近几年来，研究了n ，0 c m c 对猕猴桃、草莓、水蜜桃等水果的保鲜作用。 n c m c 的螯合作用在保存肉类方面也发挥了有利的作用，它能避免己醛和不 愉快气味的形成，起抗氧化的效果。 据报道，将c m c 作为增稠稳定剂，与果汁、酸味剂、甜味剂、维生素、牛磺 酸配方成的饮料，具有活血和抗过敏的功效。 2 3 3 化妆品工业上的应用 羧甲基壳聚糖由于其优良的水溶性、乳化性、成膜性能适于制备水质性化妆 品的功能性成分。它在水中的粘度比其它的保湿剂要高，持续保湿性能优于透明 质酸，可代替昂贵的透明质酸用于高级护肤品，而它对皮肤的保健用与透明质酸 相同。在加热过程中它不易发生粘度降低、凝胶化、沉淀等变化。0 2 5 的c m c 水溶液在广泛的p h 范围内，即使是高温和长期加热，都非常稳定。特别适合与那 些需要加热和杀菌的化妆品。另外，它还可以用于头发高级固定剂，无毒且头发 光泽好，还有抗静电作用 5 1 1 。 除此之外，c m c 还可用于金属离子的提取和回收、整和过渡金属离子、纯化 水等多方面的用途。 2 4 论文选题目的及意义 自由基是带有未成对电子的分子或离子，具有很高的反应活性。生物体内在 自身的新陈代谢中会产生大量的活性氧自由基。正常情况下，体内氧自由基的产 生和清除是平衡的。一旦失衡，就会通过生物分子的脂质过氧化、蛋白质的变性、 7i 上海海洋大学硕士学位论文 酶的失活等过程伤害机体，导致衰老、肿瘤、炎症、癌变等严重疾病【52 | 。及时清 除体内过剩的氧自由基，就能有效地预防、减轻或消除相关病症。利用抗氧化剂 延缓或降低人体因氧化而受到的危害，是一条十分重要的预防途径。作为具有优 异生理活性的天然多糖，壳聚糖及其衍生物的抗氧化作用也日益受到了广泛的关 注【5 3 】。 研究表明羧甲基壳聚糖具有抗脂质氧化的作用【5 4 】，使兔血清中氧化型低密度 脂蛋白及丙二醛含量降低，抑制了脂质的过氧化。n ，o 羧甲基壳聚糖及其乳酸盐、 吡咯烷羧酸盐对抑制熟肉的氧化非常有效，冷藏9 天后的熟肉风味几乎不变【5 5 1 。这 主要是由于壳聚糖衍生物和自由铁离子形成螯合物，从而抑制了铁离子对过氧化 物生成的催化作用，达到了防止食品变质的目的。通过化学发光法测定羧甲基壳 聚糖的抗氧化能力发现 5 6 1 ，当浓度为1 2m g m l 时，它对超氧阴离子自由基0 2 的 清除率达到了1 3 4 。x u e 等人【57 】也证实了n ，o 羧甲基壳聚糖和羟丙基壳聚糖等水 溶性壳聚糖衍生物有较好的抗氧化性。此外，分子量的高低对抗氧化能力也存在 着一定的影响。实验表明，高分子量羧甲基壳聚糖对羟基自由基o h 基本没有清除 能力，而降解之后得到的低分子量羧甲基壳聚糖抗氧化活性得到极大的改进【5 引， 同样降解得到的低分子量羧甲基壳聚糖对0 2 。也有很好的清除效果【5 9 1 。壳聚糖在醚 化后，取代基破坏了壳聚糖的原有结构，降低了分子间力，活性羟基和氨基数目 和位置的不同导致了其抗氧化能力发生改变。 如上所述，c m c 的抗氧化性能一直是壳聚糖研究领域的热点课题之一。与此 同时，随着应用范围逐渐扩大，对c m c 的深入研究需求日渐凸显。因此，对c m c 取代位置和取代度和抗氧化活性之间的相关规律的研究显得非常重要。但目前这 方面的文献报道甚少，基于此，我们以低聚壳聚糖为原料，通过控制制各条件， 合成了一系列不同取代位置和取代度的羧甲基壳聚糖，并全面考察抗氧化活性， 分析反应位点和反应程度对羧甲基壳聚糖抗氧化性的影响规律，以期为促进天然 多糖的选择性功能化及拓展它们在生物医药尤其是抗氧化领域的应用提供据。 8 上海海洋人学硕士学位论文 第三章不同取代度n ，o 羧甲基壳聚糖的抗氧化性能 3 1 概述 壳聚糖是d 一氨基葡萄糖通过d 1 ，4 糖苷键连接起来的聚合物，其结构单元中有 羟基和氨基，具有潜在的自由基清除活性。从壳聚糖的结构特点来看，其不仅具 有多个反应位点( 2 一、3 和6 - o h ) 与自由基发生反应，同时其独特的阳离子特性 ( - - n h 2 ) 和n h 2 具有很强的对金属离子的螯合能力，可从多种途径来参与抗氧 化过程。可以预见壳聚糖及其衍生物将是一类比其他天然多糖、多酚和和黄酮类 物质更为有效的抗氧化剂。 3 2 实验部分 3 2 1 材料与仪器 低聚壳聚糖，购自浙江金壳生物化学有限公司( 凝胶色谱测定其分子量为 5 0 0 0 d a ) 。 鲁米诺，d p p h ，购自s i g m a 公司。 其余试剂均为分析纯，购自上海化学试剂公司。 抗氧化测试所需溶液由二次蒸馏水配制。 i f f m - - d 型流动注射式化学发光仪，西安瑞迈电子科技有限公司。 7 9 - 3 型恒温磁力搅拌器，上海司乐仪器有限公司。 d e l t a 3 2 0 s 型p h 计，梅特勒一托利多仪器上海有限公司。 3 2 2n ，o 羧甲基壳聚糖的制备及表征 将5g 壳聚糖加入到5 0m l4 2 n a o h 溶液中，充分溶胀之后转至三口烧瓶中 并加入5 0m l 异丙醇，共置3 0m i n 后加入6g 的氯乙酸。升温至6 0 反应3h 。 冷却后，溶液用冰醋酸调节p h 至中性，用无水乙醇沉淀，用9 5 的乙醇及无水 乙醇反复洗涤。将合成的产物于6 0 真空干燥，即得到产物n ，o 。羧甲基壳聚糖a ( n o a ) 。利用相同的实验方法，分别加入4 和8g 氯乙酸制得产物n ，o 一羧甲基 壳聚糖b 和c ( n o b 和n o c ) 。 9 上海海洋大学硕士学位论文 红外光谱在e q u n o x 5 5 傅立叶红外拉曼光谱仪上进行，采用k b r 压片法制 样，测定波数范围为5 0 0 - 4 0 0 0c r n 一，分辨率为0 8c m 一。 取代度通过电位滴定法测得【删。准确称取样品0 2g ，溶于2 0m l0 1m o l l 盐 酸标准溶液中，用o 1m o l l 氢氧化钠标准溶液滴定，记录氢氧化钠标准溶液体积 ( m l ) 与p h 值对应关系，可得电位滴定曲线，用二阶微商法确定突跃点，从而 计算羧甲基壳聚糖的取代度。 3 2 3n ，o 羧甲基壳聚糖对超氧阴离子自由基的清除 用p h = 1 0 2 0 的o 5m o l l n a z c 0 3 n a h c 0 3 缓冲溶液配制浓度为1 5 1 0 。3m o l l 的鲁米诺溶液，用1 1 0 。3m o l l 的盐酸配制浓度为o 1m o l l 的邻苯三酚储备液， 使用前用去离子水稀释至1 x 1 0 4 m o l l 。以缓冲液作为溶剂，配制成不同浓度的样 品溶液。用流动注射化学发光分析仪依次测定从稀到浓的样品溶液，读出峰面积。 清除率= ( a o a i ) a o 1 0 0 。式中舢为空白溶液峰面积；a i 为样品溶液峰面积。 经s o d ，过氧化氢酶及甘露醇检测，该体系产生的自由基为超氧阴离子0 2 。 3 2 4n ，o 羧甲基壳聚糖对d p p h 自由基的清除 在装有2m l 的浓度为l x l 0 4m o l l d p p h 无水乙醇溶液的比色管中，力n x , 不 同浓度的样品溶液2m l ，摇匀，3 3 c 避光静置半小时，在5 1 7n n l 处测量吸光度 a i 。用去离子水代替样品溶液，得吸光度，无水乙醇代替d p p h ，得吸光度a j 。 清除率= 1 一( a i a j ) 1 0 0 6 。 3 2 5n ，o 羧甲基壳聚糖还原能力的测定 还原能力根据文献【6 2 韧0 定并稍做改进。取2m l 不同浓度的样品，加入p h = 6 6 的0 2m o l l 磷酸缓冲液1 铁氰化钾溶液各2 5m l ，混匀，5 0 水浴2 0m i n 后迅 速冷却，加入2 5m l l 0 三氯乙酸溶液，混匀后在2 0 0 0r m i n 下离心1 0m i n ， 取 上清液2m l ，加入2 5m l 去离子水和o 5m l 0 1 的三氯化铁溶液，静置十分钟 后在7 0 0n t n 处测定吸光度。 3 2 6n ，o 羧甲基壳聚糖对过氧化氢的清除 以p h 7 4 的磷酸盐缓冲溶液配制浓度为8 x 1 0 4m o l l 的h 2 0 2 溶液。取2m l 上述溶液加入2m l 不同浓度的样品溶液，混合均匀，静置1 0m i n ，在2 3 0n m 处 测量其吸光度a i 。用去离子水代替样品溶液，得吸光度。去离子水代替h 2 0 2 磷酸盐溶液，得a j 。用下式计算清除率：清除率( ) = 1 一( a i a j ) a 0 x 1 0 0 。 1 0 上海海洋火学硕士学位论文 3 3 结果与讨论 3 3 1n ，o 羧甲基壳聚糖的红外光谱及取代度 w a v e n u m b e r s c m 。1 图3 - 1c o s ，n o a , n o b 和n o c 的红外光谱 f i g u r e3 - 1f r rs p e c t r ao f c o s ，n o an o ba n dn o c 红外光谱是结构表征的有力工具，它能明确地提供基团信息。醚化之后，衍 生物n o a 、n o b 和n o c 与原料低聚壳聚糖c o s 的结构变化如图3 1 所示。所有 样品均在1 1 0 0c m _ 附近有较强的多糖特征吸收峰。在n o a 、n o b 和n o c 的红外 谱图中，1 4 2 0c m 。附近出现了羧酸负离子c o o 的对称伸缩振动吸收峰【63 | 。壳聚 糖中1 6 3 3 、1 5 6 0c r n 叫处分别为酰胺i 带和i i 带，在n o a ，n o b 和n o c 中二峰重 合为1 6 1 0c m 。1 附近单峰，且强度增加，是n h ，羧甲基化的标志。另外，3 4 0 0c m - t - o h 吸收峰明显变窄，这是由于c 6 位上o h 发生了醚化反应，o h 减少而引起的。红 外图谱表明，所合成产物均为n ，o 羧甲基壳聚糖。 经测定，其总取代度( d s ) ，氨基取代度( d s n ) 以及羟基取代度( d s o ) 的大, 1 , 5 0 表 3 1 所示。由此可见，产物的总取代度随着氯乙酸加入量的增多而升高。 上海海洋大学硕七学位论文 表3 1n o a 。n o b 和n o c 的取代度 t a b l e3 - 1s u b s t i t u t i n gd e g r e e so fn o a , n o ba n dn o c 3 3 2n ，o 羧甲基壳聚糖对超氧阴离子的清除 ： 6 。4 8 = 撒 一一noc 024681 01 21 41 6 c o n c e n t r a t i o n ( m g m l ) 图3 - 2n o a ，n o b 和n o c 对超氧阴离子的清除曲线 f i g u r e3 - 2s c a v e n g i n ge f f e c to fn o a , n o ba n dn o co ns u p e r o x i d ea n i o n 超氧阴离子0 2 。是一种毒性很大的活性氧刚】，对