（理论物理专业论文）重离子致dna损伤及修复的研究.pdf

浏北t 业人学螂 j 学位论文 重离子致d l g t 损伤及修复的研究 摘要 d n a 是生物体中一类最基本的大分子，是遗传信息的载体，是电离辐射引致细胞杀伤 或转化的主要靶分子。电离辐射通过直接或自由基的间接作用使d n a 产生各种损伤，其 中双链断裂( d s b ) 是辐射所致生物效应中最重要的原初损伤。损伤后的d n a 能否被正 确修复，关系到基因的突变、细胞的存活乃至癌变。研究重离子诱发的d n a 链断裂及修 复对重离子治癌、寻找抗辐射防护制剂和核辐射的危险性评估具有重要的意义。 本课题从实验和理论两个方面对重离子诱发的d n a 双链断裂进行了研究，主要工作 有： 在实验工作方面： ( 1 ) 将辐照方式进行了改进，首先用重离子轰击金靶，再利用q 3 d 磁谱仪的散焦作 用形成的均匀散射重离子束对样品进行辐照，代替了原来的在重离子扫描管道上用离子束 对样品的直接辐照方式，从而提高了辐照的均匀性。 ( 2 ) 利用h i 一1 3 串列加速器产生的两种能量的重离子7 “，对d n a 溶液和添加自由 基清除剂甘露醇的d n a 溶液分别进行了辐照，并通过原子力显微镜( a f m ) 观察，发现 在相同剂量下，d n a 样品经过高l e t 的离子照射后的碎片中短碎片比低l e t 情况明显增 多，说明高l e t 值的重离子更容易诱发d n a 双链断裂。加入甘露醇后，在1 0 6 y 剂量的 辐照后，d n a 样品图像中仍存在环状样品，而无甘露醇的样品中只有线性d n a ，说明在 重离子诱发的d n a 双链断裂断裂过程中所产生的自由基起着重要的作用。 ( 3 ) 对经重离子7 “辐照后的d n a 样品，进行了在无细胞提取物的催化下的末端连 接实验。凝胶电泳分析结果表明，经过无细胞提取物催化后，在d n a 样品中并没有出现 二：聚体，而且反应后的条带与反应前的相比较，线性的比例明显增加。对产生这种现象的 原因，尝试着作了些分析。 二在理论方面：用随机断裂模型分析了重离子电离辐射致质粒d n a 双链断裂( d s b ) 的片段长度分布，分析表明在低剂量时，随机断裂模型不能描述d n a 的碎片分布。在较 高剂量时，随机断裂模型可以较好地再现实验结果，说明了在较高剂量情况下，重离子诱 发的d n a 碎片的长度分布具有随机统计性质。还尝试用t s a l l i s 熵模型分析了d n a 碎片的 k 度分布，相似的是，在较低剂量时t s a l l i s 熵模型同样不能描述实验结果。 关键字：重离子，质粒d n a ，原予力显微镜，自由基，末端连接，随机断裂模型，t s a l l i s 熵模型 亚离r 敏d n a 损协披修复的 i j f 究 s t u d y o fd n al e s i o ni n d u c e db yh e a v yi o n sa n d r e p a i r a b s t r a c t d n ai sc o n s i d e r e dt ob et h em o s ti m p o r t a n tb i o - m a c r o m o l e c u l ea n dm a i nt a r g e tm o l e c u l e r e s p o n s i b l ef o ra l lb i o l o g i c a le f f e c t s m a n yk i n d so fd a m a g ec a nb ei n d u c e db yd i r e c tr a d i a t i o no r i n d i r e c te f f e c to ff r e er a d i c a l d n ad o u b l es t r a n db r e a k s ( d s b s ) a r ec o n s i d e r e dt ob et h em o s t i m p o r t a n ti n i t i a ld a m a g er e s p o n s i b l ef o ra l lb i o l o g i c a le f f e c t si n d u c e db yi o n i z i n gr a d i a t i o n w h e t h e rd n al e s i o ni sr e p a i r e da c c u r a t e l yo rn o t ，w h i c hi sr e l a t i o nt om u t a t i o no fg e n e ，f a t eo f c e l la n dc a n c e r a t i o n t h r o u g hs t u d y i n gd n ad s b si n d u c e db yh e a v yi o n s ，i ti si m p o r t a n t s i g n i f i c a n tf o rc a n c e rt h e r a p yb yh e a v yi o n s ，m e d i c a m e n ta g a i n s tr a d i a t i o na n dt h ed a n g e r o u s a s s e s s m e n to f r a d i a t i o n i nt h es u b j e c t ，d n ad s b sp r o d u c e db y7 l ii o n si r r a d i a t i o na r es t u d i e di ne x p e r i m e n ta n d t h e o r yt h em o s tw o r ki sa sf o l l o w s i n e x p e r i m e n t ，d n as a m p l e sa r ei r r a d i a t e db yt h ei o n sb e a ma f t e rs c a t t e r i n ge q u a b l yb y q 3 di np l a c eo f i r r a d i a t i n gd i r e c t l yt h r o u g ht h es c a n n i n gp i p e l i n e ( 1 ) e f f e c t so fl e ta n df r e er a d i c a li nt h ed n a d o u b l es t r a n db r e a k sp r o d u c e db y7 l ii o n s r r a d i a t i o na r ei n v e s t i g a t e du s i n gt h ea t o m i cf o r c em i c r o s c o p y ( a f m ) t h ee x p e r i m e n ti s p e r f o r m e da tt h eh i 一13t a n d e ma c c e l e r a t o rn u c l e a rp h y s i c sn a t i o n a ll a b o r a t o r yo fc h i n a i n s t i t u t eo fa t o m i ce n e r g y ( c i a e ) t h ed n as a m p l e si nt e b u f f e ra r ei r r a d i a t e dw i t hd o s eo f 10 g y t h en u m b e ro fs h o r t e rf r a g m e n t so fl i n e a rf o r md n ai r r a d i a t e db yh i 曲- l e ti o n si sl a r g e r ；1 t h a nb yl o w l e ti o n s i ts h o w st h a th i g h l e tr a d i a t i o ni n d u c e sd s b sm o r ew h e nt h em a n n i t o i sm i x e dw i t hd n a ，t h ei n t a c tc i r c u l a rf o r md n ai ss t i l lo b s e r v e du s i n ga f m i ti n d i c a t e st h a t t h ef r e er a d i c a lh a sd e f i n i t ee f f e c ti nt h ed n ad o u b l es t r a n db r e a k si n d u c e db yh e a v yi o n s ( 2 ) t h ee x p e r i m e n to fd n ae n d - j o i n i n gc a t a l y z e db yc e i l f r e ee x t r a c ti sp e r f o r m e da f t e r7 l i o n sr a d i a t i o n t h er e s u l to fg e le l e e t r o p h o r e s i ss h o w st h a tt h e r ea r en o td i m m e ra n dt h ef r a c t i o n o fl i n e a rf r a g m e n ti n c r e a s e si np r o p o r t i o nt ot h es u p e r c o i l e df o r md n a w et r yt oe x p l a i nt h e r e a s o no f t h ep h e n o m e n o n i nt h e o r y , t h el e n g t hd i s t r i b u t i o no fd n a f r a g m e n t si n d u c e db y7 l ii o n i z i n gr a d i a t i o n i s f i t t e dw i t ht h er a n d o mb r e a k a g em o d e l t h ef i t t i n gr e s u l ts h o w st h a tt h er a n d o mb r e a k a g em o d e l c a n n o td e s c r i b et h ed i s t r i b u t i o no fd n af r a g m e n t si nl o w e rd o s e s ，w h i l et h er a n d o mb r e a k a g e m o d e lc a nr e p r o d u c et h ee x p e r i m e n t a ld a t ai nh i g h e rd o s e s i ti n d i c a t e st h a tt h el e n g t h d i s t r i b u t i o no fd n a f r a g m e n t sh a sr a n d o ms t a t i s t i c a lf e a t u r ei nh i g h e rd o s e s t h et s a l l i sm o d e l i sa t t e m p t e dt of i tt h el e n g t hd i s t r i b u t i o no fd n af r a g m e n t s t h ef i t t i n gr e s u l ts h o w st h a tt h e s a m ep r o b l e mi si ne x i s t e n c e k e yw o r d s ：h e a v yi o n s ，p l a s m i dd n a ，a t o m i cf o r c em i c r o s c o p y , f r e er a d i c a l ，e n d - j o i n i n g ， t h er a n d o mb r e a k a g e ，t s a l l i sm o d e l 独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学化论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写的研究成果，也不包含为扶得河北工业大学或其他教育机构的学位或证书所使用过 的材料。与我一同工作的同志对奉研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表 示了谢意。 学位论文作者签名：孑u 哼易金 月期：抑、6 厂 关于学位论文版权使用授权的说明 本学位论文作者完全了解河北工业大学有关保留、使用学位论文的规定。特授权河北 工业大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文 的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：i j 身岛仓 导师签名 r 觏：妒 6 - f 黾蚣：协l 、6 、， 第一章绪论 1 - 1 重离子致d n a 损伤及修复研究的意义 d n a 是生物体中一类晟基本的大分子，是遗传信息的载体，也是电离辐射引致细胞杀伤或转化的主 要靶分子。重离子辐射可通过直接作刷和白由基的间接作_ l = | 引起d n a 的各种损伤，其中d s b 是辐射 所致生物效应中最重要的原扔损伤。d n a 受到损伤币，细胞的修复系统会启动，损伤能否被正确修 复，关系到基因的突变或细胞的死亡，从而影响人类的健康。 随着人类向外太空的发展，重离子对于宇航员的伤害越来越为人们所关注。在太空辐射中，重粒子 虽然只占总剂量的1 0 口j ，但是由于重粒子的高l e t 值、局部沉积能量大和在水中呈现更加复杂的径 迹结构i j l 等特点，能够更有效的诱发更加复杂的d n a 双链断裂，其对于宇航员造成的伤害是不容忽视 的。宇航员受辐照后的直接伤害是不可能完全避免的，而自由基造成的间接伤害可以通过抗辐射制剂的 庇削使伤害程度减少到最小。神州五号的发射成功和神卅六号的即将发射，使得寻找合适的抗辐射制剂 变得越来越迫切。在重离子治癌中，正常的组织会受到不同程度的伤害，利用自由基清除剂将正常组织 所受的伤害程度减少到最小，从而可以使重离子治癌达到更好的效果。因此研究自由基在重离子诱发的 d n a 双链断裂中的影响，可以为寻找抗辐射制剂和重离子治癌的研究提供基础的实验数据。 无论是太空辐射、核辐射、还是重离子治癌，辐射后受损d n a 的修复都是非常重要的环节。受到 辐射后d n a 结构能否得到正确的修复，关系到遗传信息的变化、细胞的命运，甚至导致癌的发生。而 重离子治癌中，受损d n a 的修复则关系着治疗的效果。从实验和理论上研究重离子诱发的d n a 损伤 及其修复，对太空辐射、核辐射及重离子治癌的评估具有重要的意义，更深入的了解重离子诱发d n a 戏链断裂的规律性，可以为重离子的危险性评估提供更可靠的依据。 本文从实验和理论两个方面对重离子诱发的d n a 双链断裂进行研究。在实验方面，从d n a 的双 链断裂和其后的末端连接两个方面进行研究。( 1 ) 用北京串列国家实验室的h i 一1 3 串列加速器产生的 两个能量的重离子7 “，经过辐射终端q 3 d 磁谱仪的散焦后，形成均匀的离子束，对含有或不舍自由基 消除剂的d n a 水溶液进行辐照，然后利用原子力显徽镜( a f m ) 赢接观测了d n a 经过辐照后的碎片 长度分布，研究了l e t 值和自由基在重离子7 “辐射诱发的d n a 双链断裂中的影响；( 2 ) 用传统的分 子生物学技术，将辐照后的d n a 样品在无细胞提取物的催化下进行末端连接实验，研究d n a 经过重 离子辐照后的重接情况，以期初步了解重离子辐照后的d n a 的修复。 在理论方面，我们用随机断裂统计模型，并尝试t s a l l i s 熵统计模型，从宏观上，对在几个剂量下 的d n a 碎片跃度分布进行了拟合，分析了d n a 双链断裂在较低和较高剂量下的特点及其随辐照剂量 增加的变化规律。 1 - 2 国内外的研究现状 由于早期重离子特别是高能重离子的产生非常困难，所以以前的辐射研究主要着眼于x 射线和y 射线。近年来，随着加速器等技术的发展，使得低、中和高能的重离子都可以产生。因此对于重离子诱 发的辐射生物学效应的研究越来越多。 在国外，对于电离辐射中自由基生物学效应的研究已经有了一段时间。1 9 9 3 年，j o n e s 等4 髓过琼 第一章绪论 1 - 1 重离子致d n a 损伤及修复研究的意义 d n a 是生物体中 类晟基本的大分了，是遗传信息的载体，也是电离辐射引致细胞杀伤或转化| ! ，勺主 婴粑分子。重离子辐射可通过直接作片j 和白由基的间接作用引起d n a 的各种损伤，其中d s b 足辐射 所致生物效应中最重要的原初损伤。d n a 受到损协后细胞的修复系统会启动损伤能否被i t 确修 复，关系剑基因的突变或细胞的死亡从而影响人娄的健康。 随着人类向外太空的发展，重离子对于宇航员的伤害越来越为人们所关注。在太空辐射中，重粒子 虽 ! 1 只占总剂量的1 0 j ，但是由于重粒子的离l e t 值、局部沉积能量大和在水中呈现更加复杂的径 迹结构”。等特点t 能够更有效的诱发更加复杂的d n a 戕链断裂，其对下宇航员造成的伤害是不容忽视 的宇航员受辐照后的直接伤害是不可能完全避免的，而自由基造成的间接伤害可以通过抗辐射制剂的 应用使伤害程度减少到最小。神州五号的发射成功和神州六号的即将发射，使得寻找合适的抗辐射制剂 变得越来越迫切。在重离子治癌中，正常的组织会受到不剧程度的伤害，利用自由基清除剂将止常组织 所受的伤害程度减少到晟小，从而可以使重离子治癌选到更好的效果。因此研究自由基在重离子诱发的 d n a 取链断裂中的影响，可咀为寻找抗辐射制剂和重离子治癌的研究提供基础的实验数据。 无论是太空辐射、核辐射、还是重离子治癌，辐射后受损d n a 的修复都是非常重要的环节。受到 辐射后d n a 结构能否得到正确的修复，关系到遗传信息的变化、细胞的命运，甚至导致癌的发生。而 重离子治癌中，受损d n a 的修复则关系着治疗的效果。从实验和理论上研究重离子诱发的d n a 损伤 及其修复，对太空辐射、核辐射及重离子治癌的评估具冉重要的意义，更深入的了解重离子诱发d n a 瑕链断裂的规律性，可以为重离子的危险性评估提供更可靠的依据。 本文从实验和理论两个方面对重离子诱发的d n a 双链断裂进行研究。在实验方面，从d n a 的双 链断裂和其后的末端连接两个方面进行研究。( 1 ) 川北京串列国家实验室的h i 一1 3 串列加速器产生的 阿个能量的重离子7 “，经过辐射终端q 3 d 磁谱仪的散焦后，形成均匀的离子束对含有或不含自由摹 清除剂的d n a 水溶液进行辐照，然后利用原f 力显微镜( a f m ) 直接观洲了d n a 经过辐照后的碎h 长度分布研究了u 汀值和自由基在重离子7 l l 辐射诱发的d n a 取链断裂中的影响；( 2 ) 用传统的分 子生物学技术将辐照后的d n a 样品在无细胞提取物的催化f 进行末端连接实验研究d n a 经过重 离千辐照斤的重接情况以期初步r 解重离子辐照后的d n a 的修复。 在理论方面，我们用随机断裂统计模型，井尝试t s a l l s 熵统计模型，从宏观上，对在几介剂量f 的d n a 碎片长度分布进行了拟台分析了d n a 双链断裂在较低和较高剂鹭f 的特点及其随辐照剂量 增加的变化规律。 i - 2 国内外的研究现状 由于早期重离子特别是高能重离子的产生非常困难，所以以前的辐射研究主要着眼于x 射线和y 射线。近年来随着加速器等技术的发展，使得低、中和高能的重离子都可以产生。因此对于重离子浒 笈冉勺辐射生物学效应的研究越来越多。 在国外，对于电离辐射中自由基生物学效应的研究已经有了一段时间。1 9 9 3 年j o n e s 等 4 强过琼 在国外，对于电离辐射中自由基生物学效应的研究已经有了一段时间。1 9 9 3 年j o n e s 等 4 强过琼 ! f i ：鸬r 毁d n a 坝伽救修复的研究 脂耱凝胶电泳分析4 h e 粒子和1y 射线辅j c 的s v 4 0d n a 厉发现，相i 高浓度白由基消除剂二甲基、哪姒 ( d e s o ) f ，4 h e 粒子诱发的d s b 产额要商1 ：y 射线如图1 1 所示。1 9 9 6 年，s c h o l z 等5 i 通过对多 种甄离r 诱发d n a 单链断裂( s s b ) 平双链断裂( d s b ) 的反应截面研究后发现，s s b 取id s b 的反脚 槭i h l 随着l e t 值的增加而增加，加入亡l 由基消除荆一巯基乙醇后，s s b 雨id s b 的反应截面都随之晰低， 但将遍高丁相同条件r x 射线诱发的s s b 平【| d s b 的反应截面。t e t s u o m i y a z a k i 等【6 1 则利用电子白旋共 振光谐分析技术，通过y 射线镉照细胞及蛋白质溶液或生命活动的刺激后，在植物、动物、细胞及蛋白 质i 苹 液中发现了k 寿命自由基。2 0 0 4 年，h a r i k u m a r k b 等 7 1 通过y 射线照射瑞士向化变种老鼠后研 究发现，辐照后的老鼠的超氧自由基水平增加，余叶子提驭物可以提高对自由基起防御作用的超氧化物 歧化酶司i 谷恍甘肽酶的活性。 柚国内，对于自由基在各个方面的效应已经有了很多的研究。七十年代后，大量文献报道：电离辐 射所致d n a 损伤与活性氧类的产生有关，某些化学物质自动氧化过程中产生的活性氧类是其致癌和致 突变的主要原因l s l 。自由基是机体的正常代谢产物，研究认为，自由基广泛涉及到细胞凋亡、衰老、退 行性疾病( 如免疫系统衰退，脑机能障磷) 以及刖瘤等多种疾病1 9 。“。在分子层面上，1 9 9 9 年，邵春林 图1 14 h e 粒子和y 射线诱发的s v 4 0 d n a 双链断裂 f i g1 1d o u b l es t r a n db r e a k so f s v 4 0d n ai n d u c e db y h ei o n sa n dyr a y s i na l 】o f f i g ，( ，o ) a r c t h ey i e l d so f s s b s ，( 一，口) a r e t l l ey i e l d so fd s b s ( o ，口) a r e t h ey i e l d s i n d u c e db y h ei o n s ，( ，) a r et h ey i e l d si n d u c e db yy r a y s b ：e f i e c to f d m s 0c o n c e n t r a t i o no bg ( s s b ) a n dg ( d s b ) b y1 h ei o n sa n dyr a y s c ：e f f e c tf ol e to ng ( s s b 、a n dg ( d s b ) i nt h ep r e s e n c eo f10 4 m o l m “ d m s oa tad o s er a t eo f a b o t i t1 6 g y s 。( 9 h e ) o r1 9 2 g y s ( yr a y s ) 等”“通过用y 射线对加了不同浓度自由基清除剂甘露醇的d n a 溶液进行辐照，结果如图1 2 所示， 电泳分析后发现，在甘露醇( m a n n i t 0 1 ) 浓度c 很低时，平均引起一个s s b 所需的剂量d o 随c 线性增 加：1 上】当c 进一步增大时，d 。开始随c 非线性地增大。随后在2 0 0 0 年i l ，又通过y 射线辐照含不同 浓度甘露醇的p b r 3 2 2 质粒d n a ，结果表明，随着自由基清除效能o 的增大，d ( 电离辐射能量沉积的 单击作用) 、b ( 电离辐射能量沉积的双击作用) 以不同的程度减小，而。的减小稃度n 4 , 得多，即a d s b 较难受自由基清除剂的影响。 自从1 9 3 5 年h o l l a e n d e r 首次提出了修复的概念，d n a 损伤的修复在近二十年来在细胞水平和分子 水平上有了重大的进展，较深入地了解了一些损伤修复的机理，如回复修复、切除修复、重复修复、错 配修复和s o s 修复等。近年来，人们对于d n a 双链断裂的重接也有了一些研究，2 0 0 0 年，s t e i n e r l o w 等【i ”通过“c o 产生的光子和1 2 5 k e v um 氮离子辐照人正常皮肤纤维原细胞再培养后发现，平均每g b p 上的d s b s 随着培养时间的增加而减少。最后趋于恒定值：但光子辐照的样品经过培养后，其d s b s 减 少约1 1 倍，比氮离子辐照再培养后样品的d s b s 减少5 倍要明显的多。随后于2 0 0 2 年【1 ”用同样的1 2 5 k e v um 氮离子辐照人正常皮肤纤维原细胞再培养后发现，小片段区间的修复半数时间( 片段数减少5 0 刈北f t 人学坝j 学位论义 州, 6 ) ij - i j 的时问) 是最长的片段i 页问的修复、r 数时问的人约1 1 1 0 。住国内，周平坤”“等州川f k k7 l i i h 场凝 胶i u 泳荆烈标记基因质粒d n a 转染技术研究辐射敏感的毛细曲管扩张性批济火澜疵患者皮肷成纤维细 胞( a t 5 b i v a ) 雨i 止常辐射抗性的人宫颁癌细胞( h e l as 3 ) d n a 般链断裂巫接修复率及其忠实性，结 果袭f 列y 射线_ ! ；i 射诱发d n a 烈链断裂的产额平j 亟接修复率，在两株细胞问无差别，而a 1 、细胞对导入 的限制性内切酶e c o r v 产生烈链断裂质粒d n a 的重接吸附的忠实性显著低于h e l a s 3 细胞，发明a t 细胞易发生d n a 错误修复。 总之，国外对于重离子诱发的d n a 烈链断裂中自由基的效应及其重接已经有了一些的研究，但娃 为数较少。在国内外关。r 重离子诱发的d n a 烈链断裂中自由基的效应的研究还很少，运川a f m 技术 对r ie h 基在重离子诱发的d n a 啾链断裂中的作m 进行研究还未见报道。 重 曹 c ( m a n n l t 0 1 ) ( m o u l ) 图1 2 平均引起一个s s b 所需的剂量d o 随着自由基清除力的变化 f i g1 2r e l a t i o n s h i po f t h ed o s ed or e q u i r e di np r o d u c i n gas s bo na v e r a g e w i t ht h ec o n c e n t r a t i o no fm a n n i t o lc o n t a i n e di nd n as o l u t i o n s 本论文共分为八章，第一章介绍了重离子辐射致d n a 损伤及修复的意义及现状；第二章介绍了电 离辐射致d n a 的损伤、自由基及其对生物生物学效应；第三章介绍了重离子辐照装置h i 一1 3 串列加速 器和q 3 d 磁谱仪及d n a 及其碎片的观测装置原子力显微镜：第四章介绍了本文的研究目标、方法和 内容：第五章介绍了l e t 值和自由基在重离子诱发的d n a 双链断裂中的影响的实验及甘露醇的清除自 由基效能；第六章介绍了重离子致d n a 双链断裂修复的初步实验研究；第七章奔绍了随机断裂统计模 犁对重离子致d n a 双链断裂后的碎片长度分布进行分析的理论计算；第八章对本文进行了总结并提出 对未来工作的展望。 里窒! ：丝呈! 垒丝丝竺堡坚些竺! ! 第二章电离辐射致d n a 的损伤及自由基的生物学效应 l b 离辐射对生物大分子的损伤既有能每传递的直接作州，也有通过水的辐解反应人越产生的 i 由基 的间接作用。自由基也是机体的三常代谢产物，它可以造成各种损伤，如可造成d n a 的碱基、糙基嗣 磷酸基的损伤、对脂质过氧化作用与生物膜的损伤和对蛋白质的损伤等。因此需要人类自身的酶类物质 如过氧化氢酶、过氧化物酶等维持其浓度的恒定；当受到外界刺激过量产生时，需要找到合适的防护荆 对其进行清除，以保证人类的健康。可以认为，对生物大分子辐射效应的研究，将成为目前平今后一段 时间内辐射i i 三物学领域的热点和前沿课题。 2 - 1 电离辐射致d n a 的损伤及其生物学意义 2 - 1 1 电离辐射致d n a 的损伤 辐射与物质的相互作用中，在1 0 。3 s 的极短时间内即可完成能量的转移，其能量转移方式各不相同， 低能x 射线或，射线通过光电效应，具有较高能量的x 射线或y 射线则通过康普顿效应，高能r 射线 主要是通过“电子对”的生成，对于带电粒子( 包括电子、质子及重离子) 辐射，能量转移的机制则为 激发，电离及核相互作用：而中子则是通过一系列的弹性碰撞来转移能量。 构成生物体基本单位的细胞可近似地看作是一个由水和各种溶质分子组成的溶液体系。辐射的直接 作用是指来自放射源的能量或离子直接作用于溶质分子、并造成结构与功能损伤的过程；而间接作用指 的是水的辐解反应产物与溶质分子之间发生的可能导致溶质分子结构变化的各种反应。电离辐射可以通 过直接作用和自由基的间接作用引致各种生物效应，包括杀伤细胞、诱导突变和诱发肿瘤。 d n a 已被公认是辐射生物学效应的主要靶分子。研究发现辐射可引起d n a 多种类型的损伤，包 括：( 1 ) 碱基变化，如脱氨基：( 2 ) 碱基脱落；( 3 ) 两链间氢键的断裂：( 4 ) 单链断裂( s s b ) ；( 5 ) 救链断裂( d s b ) ；( 6 ) 螺旋内的交联；( 7 ) 与其它d n a 分子的交联：( 8 ) 与蛋白质的交联”j 。链断裂 是电离辐射所致d n a 损伤中较为常见的重要形式。d n a 双螺旋结构中的一条链断裂，称为单链断裂 ( s i n g l es t r a n d b r e a k ，s s b ) ，两条互补链于同一对应处或相邻处同时断裂时，称之为双链断裂( d o u b l e s t r a n db r e a k ，d s b ) 。链断裂的形成可以直接由于脱氧戊耱的破坏或磷酸二酯键的断裂，也可以间接通 过碱基的破坏或脱落所致。其中d s b 是辐射所致生物效应中最重要的原初损伤，非重接性的d s b 则被 认为是细胞杀伤效应的最重要的损伤。特别是高l e t 的重离子更容易诱发d n a 的非重接性双链断裂， 导致明显的生物效应。图2 1 所示为d n a 受到的损伤方式及产生的各种损伤，左图描述的是电离辐射 对d n a 分子的作用方式，右图描述的是电离辐射诱发d n a 的各种损伤。 2 - 1 。2 电离辐照致d n a 损伤的生物学意义 众所周知。d n a 是细胞生长、发育、繁殖和遗传的重要物质基础。它蕴藏着丰富的遗传信息，通 过转录和翻译，指导着蛋白质和酶的生物合成，主宰着细胞的各种生理功能。 d n a 结构的辐射损伤在细胞的突变和致癌机制中起着重要作用，与细胞凋亡及老化等过程亦有密 切关系。另外细胞为了维护其生命和正常的机能活动，通过多种途径对各种类型的d n a 损伤进行修 复所以决定细胞命运的不仅是损伤的严重程度，其修复能力与修复机制亦十分重要。 型些! 兰垒兰竺：! ：兰竺篁兰 s i n g l e s t r t m d b r e a k m o d i f i e db a s e ( o x i d a t i o n ) a b o s i cs i t e 图2 1电离辐射致d n a 的损伤 f i g2 1d n al e s i o n si n d u c e db yi o n i z a t i o n 2 - 2 自由基的效应 2 2 1 自由基的简介 。自由基的概念 自由基是指能够独立存在、核外带有未配对电子的原子或分子。所谓“未配对电子”，即单独占据 原子或分子轨道的电子。 自由基化学反应性主要来自于未配对电子，但也与自由基分子的其他结构部分有关。对于分子结构 不同的自由基，其化学性质也不一致。与一般化学反应一样，自由基反应同样受到室温、反应物浓度、 d h 值等条件的影响，其中温度的影响最为显著。 二二活性氧与氧自由基 氧( 0 2 ) 是需氧生物赖以生存的最重要的元素之一。0 2 在生物体内完成对各类物质氧化和自身还 原的过程中不断为生命活动提供着能量。但在这一代谢过程中也可产生一些次级产物，如。o h 、h 2 0 2 等，这些次级产物又可进一步衍生出一些活性物质，如脂质过氧化物和单线态氧( 1 0 2 ) 等。这些0 2 的次级产物或衍生物具有较o ：更为活跃的化学性质，并可能对机体产生损伤效应。从这一角度出发。 将此类较0 2 更为活跃的物质统称为活性氧( r e a c t i v e o x y g e ns p e c i e s ，r o s ) 。 三通过水的辐解产生的自由基 在生物体中，水的含量约占生物体总重量的8 0 。因此可以认为，辐射引起的生物效应很大程度 l ：来自于辐射对水的作用。笼统地讲，辐射使水分子分解为o h 和h 两种自由基的反应称为水的辐解 反应。 水受辐解作用生成自由基有两种机理，其一是水分子的电离；其二是水分子的激发。水分子电离生 成自由基又可以大致分为两个步骤： ( 1 ) 水分子电离生成带正电荷的自由基( h 2 0 “) 和电子e h 2 0 h 2 0 + + e h 2 0 一h + + o h 羟自由基。o h 是具有极强氧化性质的氧化剂。 重斟r 致d n a 损伤技修复的研饨 ( 2 ) 水台电子的继发反应 任辐解作用下电子可从水分子中逸山，逸山之初的电子具有足够的动能，使其可以远离原米的水分 严定的距离。这样的距离已使电子不可能再同纠原米的水分子上。游离的电子通过与其他水分j 二的碰 撞而消耗动能，最终被水分子“俘获”形成所谓的水合电子( a q u e o u se l e c t r o n s e 。) 。与水合i b 子接 近的水分子受其影响可分解为o h 和。h 自由基。 2 e 。+ h 2 0 一o h + h水合电子是还原性质极强的还原剂，故也被认为是一种自由基。 水分子在辐解作用下激发生成自由基的过程较为复杂，反应的细节尚不十分清楚。理论上认为，水 分子受辐射激发后生成激发态水分子( h 2 0 ) ，h 2 0 较基态水分子具有更高的能量，足以使h o 键 断裂而解离为o h 和h 自由基( o h 键断裂仅需耍5 e v 的能鲑) ： 卜i2 0 h 2 0 一o h + h 图2 2 总结了水分子在辐解作用一f 生成自由基的两种机理。 啪竺，啪+ + 。一 jy 电 n + + 回回田哪 影弋 团+ 囤田删 卜 地。j ! - n a o 一围+ 团 图2 2水分子在辐射作用下生成自由基的两种机理 f i g2 2t h ed e c o m p o s i n gm e c h a n i s mo f w a t e r a f t e ri o n i z a t i o n 水在辐解反应过程中生成的三种自由基由于自身极强的氧化或还原性质，可引发出各种反应，其中 除少数情况下三种自由基重新又组成水分子外，更多的是形成新的分子或其他类型的自由基。 形成新分子的反应主要有： o h + o h h 2 0 2 h + h h 2 在有氧存在的条件下，h 与e a q 一均可与氧反应，生成h 0 24 和掰自由基： h + 0 2 一h 0 2 e a q + 0 2 一0 2 ； 2 - 2 2 自由基的生物学效应 2 - 2 2 1 自由基对生物大分子的损伤 一f 1 由基对d n a 的损伤 d n a 是生命信息的载体，是细胞中最重要的生物大分子之一。d n a 的主要组成部分碱基、核穗和 磷酸酯键都可能遭受自由基的攻击，造成碱基与核糖氧化、链断裂、与蛋自质交联等多种类型的损伤。 ( 1 ) 碱基的损伤 o h 和h 自由基与嘧啶碱基可发生加成和抽氢两类反应。由于。o h 和h 都具有亲电子性，反应 发生的部位将取决于嘧啶环中各原子的电子密度。与嘧啶碱基的情况相似，。o h 和h 自由基在喋呤环 河北t _ p 人学坝i 。学位论文 l 也可以发生加成和抽氢反麻， e 。自由基与嘧啶或噤呤碱基反麻的结果主婴是使其加合i u 子，生成带电荷的碱基臼由基。l hj e i 台的部1 ：i 7 ：多在i 密啶环的第4 位碳原子，蝴蝶呤环的第2 利第8 位碳原子。加台电子后的碱基自由基i ，j 经 过瓶子化反廊发生分子结构的重排，_ i 手在氧的作j hf 形成不同类型的氧化产物。 d n a 的四种碱基之间的l h 予亲和力也存在著异，四种碱基对l b 子亲平i | 力的大小依次为：胸腺嗡啶 胞嘧啶 腺嘌呤 鸟嘌呤。 ( 2 ) 核糖的损伤 核糖在d n a 分子中既结合碱基，义结台磷酸，将四种碱基连在一起而成为d n a 的链结构。冈此， 核糖损伤的意义并不在于其自身，而在于损伤引起的d n a 链性结构的改变。d n a 的碱基缺火与链断 裂损伤都是以核糖的损伤为先导的，可以认为核糖的损仂是碱基损伤的继发性结果。 ( 3 ) 磷酸基的损伤 现在认为，d n a 分子中磷酸基团的损伤主要由辐射的直接作用所造成。磷酸基吸收辐射能量后变 为自由基并释放出e 。一： ( r o ) 2 p ( o ) o 一一( r o ) 2 p ( o ) o - b e 磷酸自由基具有较强的氧化性和一定的抽氢反应能力，既可使临近的碱基氧化，也可在核糖的第4 位碳原子上进行抽氢反应。如上所述，核糖损伤的后果是脱去磷酸, b i 释放碱基，即造成d n a 的链断裂 和碱基缺失损伤。 研究表明，核内d n a ( n d n a ) 和核外d n a ( 线粒体d n a ，m t d n a ) 对自由基氧化损伤的反应 性不同，m t d n a 易受自由基攻击，原因可能有：m t d n a 没有组蛋白和非组蛋白的保护性结合；m t d n a 的损伤修复能力比n d n a 差：m t d n a 与线粒体内膜相连，易成为自由基攻击的目标；m t d n a 的损伤 易引起蓄积l j 。 二自由基与脂质过氧化和对生物膜的损伤 氧自由基能攻击生物膜磷脂中的多不饱和脂肪酸( p o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i d ，p u f a ) ，引起脂质过氧 化作用，并形成脂氢过氧化物，后者不稳定，分解成一系列复杂产物，包括新的氧自由基，形成脂质过 氧化的链式反应。可引起细胞损伤：膜脂改变造成膜功能改变和膜酶损伤；脂质过氧化过程中形成的活 性氧对酶和其它细胞成分的损伤；脂氢过氧化物的分解产物( 特别是醛类产物) 对细胞及其成分的毒性 效应。 三自由基对蛋白质的损伤 脂质过氧化产物醛类物质可造成蛋白质中的巯基和氨基的氧化性损伤。自由基对蛋白质也可造成直 接损伤，如o h 自由基处理过的牛血清蛋白、免疫球蛋白和超氧化物岐化酶等不同蛋白质，发现处理 后蛋白质有抗原性显著增加的现象；另外还有一级结构出现肽链断裂、氨基酸组成变化、出现异常氨基 酸和产生羰基、铜离子被还原或丢失、与铜离子结合的组氨酸残基氧化的变化；空间构象表现为紧密结 构趋于松散；还有疏水性、顺磁性、紫外线吸收光谱等酶的物理性质的变化i i 】。 2 - 2 2 2 自由基与生命活动的关系 生物体内一定的自由基水平是维持正常生命活动所必须的，在生理条件f ，正常的代谢中，自由基 可以通过各种途径生成。正常细胞每天能产生达1 0 “的活性氧自由基，它们参与着细胞代谢，有着积 极的一面。但自由基聚积过多将对组织造成严重损伤，甚至导致细胞死亡【j 。所以自由基与细胞的增 值、分化、凋亡、坏死等多种病理、生理现象密切相关。 自由基与细胞凋亡 细胞凋亡( a p o p t o s i s ) 是于1 9 7 2 年由k e r r 等提出的一个有别于细胞坏死( n e c r o s i s ) 的概念。k e r r 等认为，细胞凋亡不仅是一个独特的形态学过程，而且是一个重要的生理现象。它在调节动物细胞群数 量上起和有丝分裂互补的作用。细胞凋亡是一种正常的细胞死亡机制j 。 活性氧( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，r o s ) 和其它自由基是机体的正常代谢产物，氧化应激( o x i d a t i v e s t r e s s ) 是导致化学的或代谢来源的r o s 产生的一种细胞内或外的状态。过量的r o s 则产生不可逆损伤， 在机体中有一套抗氧化防御系统来防止氧及其代谢产物对机体的毒性效应，因此氧化和抗氧化的平衡是 最高了敛d n a 蛳伤及修复的_ ! j 究 决定细胞生存状态的重要因素。而氧化应馓( 氧化利抗氧化不平衡状态) 则可能介导细胞凋亡。支持这 一假税的依据有： ( 1 ) 细胞内r o s 水平的增加或细胞l j j 抗氧化剂水平的降低