（无机化学专业论文）细胞色素b5与细胞色素c电子传递的研究.pdf

细胞色素b ，与细胞色素c 电子传递的研究 摘要 电子传递反应在生物体的光合作用、呼吸作用、药物代谢以及其它一些生化 途径中具有重要地位，研究蛋白之间电子传递的机制、调控因素等一直是化学生 物学领域的重要课题。细胞色素b j 是含血红素的电子传递蛋白。它与细胞色素 c 之间的电子传递，是研究蛋白质电子传递机制的理想体系。本论文以二十余种 细胞色素b 5 的突变体蛋白为研究对象，对细胞色素b 5 和细胞色素c 的静电识别、 电子传递通道等问题进行了研究。 细胞色素b ，在与细胞色素c 进行电子传递的过程中，蛋白和蛋白之间存在 着多种相互作用，如细胞色素b j 血红素暴露于溶剂一侧高度密集的带负电荷的 基团g l u 4 4 、g i u 4 8 、g l u 5 6 、a s p 6 0 以及血红素丙酸根与细胞色素c 表面带正电 荷的氨基酸残基通过静电作用进行识别；细胞色素b j 中的v a l 4 5 和v a l 6 1 分剔与 细胞色素c 的a l a 8 1 和p h e 8 2 存在疏水相互作用；p h e 3 5 、p r 0 4 0 、t y r 7 4 等残基 组成了细胞色素b j 表面疏水斑区，由它构成的氢键网络有可能为细胞色素b j 和 细胞色素c 电子传递提供通道等等。为了了解这些相互作用分别对电子传递过程 的影响，我们进行了一系列的研究。以细胞色素b je 4 4 a 、e 5 6 a 、e 4 4 5 6 a 、 e 4 4 4 8 a 、e 4 8 5 6 a 、e 4 8 a ，d 6 0 a 、e 4 4 4 8 5 6 a 、e 4 4 5 6 a ，d 6 0 a 、e 4 8 5 6 a ，d 6 0 a 、 e 4 4 ，4 8 5 6 山口6 0 a 和e 4 3 4 4 4 8 5 6 刖d 6 0 a 突变体蛋白和血红素丙酸根甲酯化的 衍生物d m e w t 、d m e e 4 4 4 8 5 6 a d 6 0 a 等为对象，系统的研究了静电作用 对细胞色素b s 细胞色素c 结合和电子传递的影响。以v 4 5 e 、v 4 5 h 、v 6 1 e 、 v 6 1 h 等细胞色素b 5 突变体蛋白为对象，研究疏水相互作用对细胞色素b 5 和细 胞色素c 结合和识别发挥的作用。此外，还以f 3 5 y 、f 3 5 l 、p 4 0 v 等突变体蛋 白为对象，探讨细胞色素b 5 表面疏水斑区在电子传递过程中的作用。 蛋白质分子的功能与其结构、性质息息相关，研究突变体蛋白的结构和基本 性质是深入理解特定的基团对蛋白发挥生物功能影响的基础。本实验室前期对细 胞色素b je 4 4 e 5 6 a 、e 4 4 4 8 5 6 a d 6 0 a 等突变体蛋白的n m r 研究表明这些突 变并没有引起蛋白整体结构的变化。在此基础上，本论文首先就细胞色素b 5 表 面带负电荷的氨基酸残基g l u 4 4 、g l u 4 8 、g l u 5 6 、a s p 6 0 及血红素上的丙酸 根对蛋白的稳定性及氧化还原电位的影响进行了研究。我们发现g l u 4 4 、g l u 4 8 、 g l u 5 6 、a s p 6 0 等残基突变为a l a 后不同程度的提高了细胞色素b j 的稳定性，这 主要是因为突变以后疏水自由能有所增加，而且细胞色素b j 旺一螺旋中电荷与偶 极的相互作用也更为有利。同时这些突变体蛋白仅引起细胞色素b j 氧化还原电 位1 0 m v 以内的变化。血红素上的丙酸根甲酯化的衍生物则由于血红素辅基与蛋 白肽链之间失去了两个氢键的相互作用而稳定性降低，并且电位也有较大改变。 本文采用紫外可见差谱方法，测量了细胞色素b j 突变体蛋白和细胞色素 细胞色素b ，与细胞色素c 电子传递的研究 c 的结合常数。结果表明：g l u 4 4 、g l u 4 8 、g l u 5 6 、a s p 6 0 和血红素丙酸根上的负 电荷的中和，都减弱了两个蛋白分子之间的结合能力，并且中和的电荷数越多， 这种变化越明显。我们注意到，这些基团所带负电荷的中和只是减弱细胞色素 b 和细胞色素c 结合的能力，并不完全破坏它们之间的结合，溶液中应该存在 着多种静电相互作用的模式。v 6 1 e 、v 6 1 h 、v 4 5 h 等细胞色素b j 突变体与细胞 色素c 的结合常数都与野生型相当。我们认为疏水相互作用的贡献并不很大，而 静电相互作用在细胞色素如和细胞色素c 结合过程中发挥着至关重要的作用。 分别用动力学快速停流法和激光闪光光解法研究了细胞色素b ，和细胞色素 c ( 锌取代细胞色素c ) 在高离子强度下的电子传递过程。动力学快速停流法的 结果表明，对于与细胞色素c 结合能力差别不大的细胞色素b j 突变体蛋白 ( f 3 5 y 、f 3 5 l 、p 4 0 v 、v 4 5 e 、v 4 5 h 、v 6 1 e 、v 6 1 h 等) ，电子传递的热力学驱 动力越大，其速率就越快。表面荷负电残基( g l u 4 4 、g l u 4 8 、g l u 5 6 、a s p 6 0 和 血红素上的丙酸根) 的突变体蛋白，它们与细胞色素c 电子传递速率和与细胞色 素c 的结合能力大致成正比。根据m a r c u s 理论，研究了热力学驱动力与电子传 递速率的关系，并得到该电子传递体系的重组能为o 6 e v 。 本文还用激光闪光光解法研究了细胞色素b j 和锌取代细胞色素c 在低离子 强度下的复合物分子内电子传递过程。在这种条件下得到的是溶液中稳定存在的 蛋白复合物的分子内电子传递速率常数。f 3 5 y 、f 3 5 l 、p 4 0 v 等细胞色素b j 突 变体蛋白的电子传递速率常数没有显示出与野生型蛋白的明显差异，基本上可 以否定细胞色素b j 表面的疏水斑区作为它与细胞色素c 电子传递通的假说。血 红素丙酸根甲酯化后使反应速率明显变慢，表明血红素丙酸根在电子传递过程 中的重要作用。g l u 4 4 、g l u 4 8 、g l u 5 6 、a s p 6 0 等表面残基电荷的中和却导致了 复合物分子内电子传递速率加快。 用b r o w n i a nd y n a m i c s 方法对两个蛋白的相互作用进行了理论模拟。结果表 明，细胞色素b 5 中g l u 4 4 、g l u 4 8 、g l u 5 6 、a s p 6 0 等突变为丙酸根后，由于残基 体积有了明显变化，氧化还原活性中心距离的缩短等因素导致了相关突变体蛋 白与细胞色素c 电子传递速率的加快。细胞色素b s f 3 5 y 和v 6 1 h 突变体与细胞 色素c 的作用模式与野生型几乎没有差别，与动力学研究的实验结果非常吻合。 综台全文工作可以看出，在细胞色素b j 和细胞色素c 电子传递体系中，( 1 ) 对蛋白分子结合和识别的贡献主要来自于静电相互作用，疏水相互作用并不是 至关重要的：( 2 ) 溶液中存在着多种作用模式，最稳定的并不一定最适合电子传 递：( 3 ) 电子传递的速率主要是由细胞色素如血红素暴露面周围的静电势、氧 化还原电动势等因素调控，同时还受到两个蛋白氧化还原活性中心距离的影响。 关键词：电子传递，细胞色素b j ，细胞色素c ，静电作用 i i 细胞色囊毛与细胞色素c 电子传递的研究 a b s t r a c t e l e c t r o nt r a n s f e r 1 ) r e a c t i o n s p l a y a n i m p o r t a n t r o l ei n p h o t o s y n t h e s i s , r e s p i r a t i o n , m e t a b o l i z a t i o na n ds o m eo t h e rb i o l o g i c a lo x i d o r e d u e t i o np r o c e s s e s t h e k i n e t i c sa n dm e c h a n i s m so f e ta l eb e i n gi n t e n s e l ys t u d i e d c y t o c h r o m eb 5r c y tb s ) i s ah e m e p r o t e i ni n v o l v e di ne t w i t hav a r i e t yo f p r o t e i n si nb i o l o g i c a lp r o c e s s e s t h e e tb e t w e e nc y tb 5a n di t sb i o l o g i c a lp a r t n e rc y t o c h o m ec ( c y t i sa ni d e a lm o d e l s y s t e m r e s e a r c hi nt h i st h e s i s f o c u s e so nt h ee l e c t r o s t a t i ci d e n t i f i c a t i o na n de t c h a n n e lb e t w e e n c y tb sa n dc y t c a v a r i e t yo f i n t e r a c t i o n sa r ei n v o l v e di nt h ee tb e t w e e nc y tb sa n dc y tc v a r i a n t so fc y tb s 饵4 4 ae 5 6 a , e 4 4 5 6 a , e 4 4 4 8 a , e 4 8 5 6 a , e 4 8 a d 6 0 e 4 4 4 8 5 6 a ,e 4 4 5 6 a d 6 0 a ,e 4 8 5 6 a d 6 0 a , e 4 4 4 8 5 6 a d 6 0 aa n d e 4 3 1 4 4 1 4 8 1 5 6 a i d 6 0 a ) a n dd i m e t h y le s t e rh e m ed e r i v a t i v e s0 ) m e w t - d m e e 4 4 4 8 5 6 a d 6 0 a ) w e r es t u d i e dt oi n v e s t i g a t e t h er o l eo f t h ee l c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o n s h y d r o p h o b i ci n t e r a e t i o n sw e r ee v a l u a t e dt h r o u g hv 4 5 e ，v 4 5 h , v 6 1 e ，v 6 1 hc y t 如 m u t a n t s a n dt h e p o s s i b i l i t yo f t h eh y d r o p h o b i cp a t c h o nt h es u r f a c eo f c y tb s a sae t c h a n n e lw a sd i s c u s s e dt h r o u g hf 3 5 yf 3 5 l , p 4 0 v c y tb 5 m u t a n t s ， t h ef u n c t i o n so f p r o t e i n sa r ec l o s e l yr e l a t i v et ot h e i rb ；t l m c t u r e sa n dp r o p e r t i e s t h u s s t u d i e so nt h es t r u c t u r e sa n dp r o p e r t i e so f p r o t e i n sa m i m p o r t a n tt ot h o r o u g h l y u n d e r s t a n dt h e i rb i o l o g i c a lr o l e s p r e v i o u ss t u d i e so fs o m ec y tb sm u t a n t sm e n t i o n e d a b o v e b y n m ri n d i c a t e dt h a tm u t a t i o nd o e sn o td i s t u r bt h eo v e r a l ls t r u c t u r e h e r e i n , w eb e g a n0 1 1 1 s t u d yw i t ht h ei n f l u e n c eo fs u r f a c ec h a r g e dg r o u p s ( g h 4 4 , g h i 4 8 ， g l u 5 6 ，a s p 6 0a n dh e m e p r o p i o n a t e ) o np r o t e i ns t a b i l i t ya n dr c d o xp o t e n t i a l w e f o u n dt h a to h a r g en e u t r a l i z a t i o no f g l u 4 4 ，g l u 4 8 ，g l u 5 6a n da s p 6 0 s l i g h t l ys t a b i l i z e s t h ep r o t e i n , r e s u l t i n gf r o mt h ei n c r e a s ei nh y d r o p h o b i ce n e r g ya n dt h ef a v o r a b l e 姆- o r , h e l i xd i p o l ei n t e r a c t i o na f t e rt h em u t a t i o n mi n f l u e n c eo nt h er e d o x p o t e n t i a l o ft h e s em u t a n t si sw i t h i n 1 0 m v e s t e r i i i c a t i o no fh e m ep r o p i o n a t e s u b s t a n t i a l l y d e s t a b i l i z e c y tb 5b e c a u s e o ft w oh y d r o g e nb o n d sl o s sb e t w e e n p r o s t h e t i ch e m eg r o u p a n dt h e p e p t i d e m a t r i x t h e b i n d i n gc o n s t a n t sb e t w e e nc y tb 5a n dc y tcw e r em e a s u r e db yu v v i s d i f f e r e n c es p e c t r a o v e r a l l ，c h a r g en e u t r a l i z a t i o no f g l u 4 4 ，g l u 4 8 ，g l u 5 6 ，a s p 6 0a n d h e m e p r o p i o n a t ew e a k e n st h eb i n d i n gb e t w e e nc y tb 5 a n dc y tc ，a n dt h em o r e n e g a t i v ec h a r g e sa r e n e u t r a l i z e dt h ew e a k e rt h eb i n d i n ga b i l i t y h o w e v e r , c h a r g e n e u t r a l i z a t i o n o n l yw e a k e n st h eb i n d i n g , b u t i td o e s n te l i m i n a t et h ee l e c t r o s t a t i c 细胞色素刍，与细胞色素c 电子传递的研究 i n t e r a c t i o n s t h e r e f o r e , t h e r em u s th em u l t i p l eo fd o c k i n gg e o m e t r i e sr a t h e rt h a na s i n g l ec o m p l e xt h r o u g hw 嫩c he tm i g h to c c t 比t h eb i n d i n gb e t w e e nv 6 1 e v 6 1 i - i , v 4 5 h c y t 幻a n dc y t cd o e s n ts h o ws u b s t a n t i a ld i f f e r e n c ef r o mw i l dt y p ec y tb 5 w e b e l i e v et h a te l 戗舡d s t 缸i ci n t e r a c t i o n sa g ee s s e m i a lt ot h eb i n d i n gb e t w e e nc y tb 5a n d c y tc ，a n dh y d r o p h o b i ci n t e r a c t i o n sm a y n o tc o n t r i b u t em u c h t h ee tb e t w e e nc y tb 5a n dc y tc ( z i n cs u b s t i m t e dc y tdu n d e rh i g hi o n i c s t r e n g t l lw a s s t u d i e dt h r o u g h s t o p p e d f l o w k i n e t i cm e t h o da n dl a s e rf l a s h p h o t o l y s i s m e t h o d i ns t o p p e d f l o ws t u d i e s , f o rt h o s em u t a n t sw h i c hs h o ws i m i l a rb i n d i n g a b i l i t yw i t hc y tc 佃3 5 yf 3 5 l , p 4 0 v , v 4 5 e ，v 4 5 i - lv 6 1 e ，v 6 1 he t c ) , t h ee t r a t e s d e m o n s t r a t eam a r k e d d e p e n d e n c eo nd r i v i n g f o r c e s w h i l ef o rt h o s em u t a n t s i n v o l v i n gg l u 4 4 ，o l u 4 8 ，g l u 5 6 , a s p 6 0a n dh e i n e p r o p i o n a t e ，t h ee tr a t e s a r e r o u g h l yc o r r e l a t e dw i t ht h e i rb i n d i n ga b i l i t yw i t hc y tc w es t u d i e dt h er e l a t i o n s h i p b e t w e e nd r i v i n gf o r c e sa n de tr a t e s a c c o r d i n gt oc l a s s i c a lm a r c u st h e o r y , t h e r e o r g a n i z a t i o no n e r g yi nc y t 如，c y t ce t s y s t e m i s0 6 e v t h ei n t r a m o l c , 圮a f l a re ti np r e f o r m e dc y tb 5 ，c y tcc o m p l e xu n d e rl o wi o n i c s t r e n g t hw a ss t u d i e dt h r o u g hl a s e rf l a s hp h o t o l y s i sm e t h o d f 3 5 yf 3 5 la n dp 4 0 v c y t 如m u t a n t ss h o wl i t t l ed i f f e r e n c ef r o m w i l dt y p ec y t 如，s ot h e h y d r o p h o b i cp a t c h o nt h es u r f a c eo f c y tb 5s h o u l dn o tb et h ee tc h a n n e li nt h i ss y s t e m e s t e r i f i c a t i o no f h e m e p r o p i o n a t e i su n f a v o r a b l ef o rt h ee tw h i l et oo u r s u r p r i s e , c h a r g e n e u t r a l i z a t i o no fg l u 4 4 , g l u 4 8 ，g t u 5 6a n da s p 6 0i n c r e a s e st h ei n t r a m o l e e u l a re t r a t e si np r e f o r m e dc y tb 5 c y tcc o m p l e x ， w es i m u l a t e dt h ed o c k i n gb e t w e e nc y tba n dc y tcb yb r o w n i a nd y n a m i c s m e t h o d t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ei n c r e a s e de tr a t e sf o rt h o s ec y tb 5m u t a n t s i n v o l v i n gg l u 4 4 ，g l u 4 8 ，g l u 5 6a n da s p 6 0 r e s u l t e df r o md i s t a n c ed e c r e a s eb e t w e e n r e d o xc e n t e r s t h ed o c k i n gb e t w e e nf 3 5 yv 6 1 hc y t 幻a n dc y tci sa l m o s tt h es s m e a st h ew i l d t y p e t h e s ea r ew e l lc o r r e l a t e dw i t h o u re x p e r i m e n t a lr e s u l t s i ns u m m a r y , f o rt h ec y tb s ，c y tce t s y s t e m , ( 1 ) m o s t o ft h ec o n t r i b u t i o nt o t h ed o c k i n gi sf r o me l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o n s ，a n dh y d r o p h o b i ci n t e r a c t i o n sa r en o t e s s e n t i a l ；( 2 ) t h e r ea r em u l t i p l eo f d o c k i n gg e o m e t r i e s i ns o l u t i o na n dt h em o s ts t a b l e d o c k i n gg e o m e t r ym a y n o tb et h eo p c i m a lf o re t ；( 3 ) t h ee tr a t e sa r er e g u l a t e db y t h e r e d o x p o t e n t i a l , t h ee l e c t r o s t a t i cp o t e n t i a l a r o u n dt h eh e i n e e x p o s i n ge d g eo f c y t 如a s w e l la st h ed i s t a n c eb e t w e e nr e d o xc e n t e r so f c y tb 5a n dc y t c k e yw o r d s ：e t , c y t o c h r o m eb 5 ，c y t o c h r o m ec ，e l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o n i v 细胞色素缸与细胞色素c 电子传递的研究 绪论 一 蛋白质分子之间的长程电子传递 电子传递反应在生物体的光合作用、呼吸作用、药物代谢以及其它一些生化 途径中具有重要地位。这些电子传递反应往往是有一系列蛋白共同参与，组成一 条有效的电子传递链。这种电子传递多为长程电子传递，两蛋白氧化还原活性位 点间的距离一般超过l o a ( m a r c u sa n ds u t i n ，1 9 8 5 ) 。 1 电子传递的理论 蛋白质分子之间的电子传递通常包括三个步骤：电子给体和电子受体之间 的碰撞( 识别) 形成前体复合物、电子在活化复合物中的传递以及电子传递复合 物的解离( m a r c u sa n ds u t i n ，1 9 8 5 ) 。这个过程可表示为 k lkk 2 a 。+ b a ：b a ：b a + b 这里a 为电子给体，b 为电子受体，k l 是活化络合物的生成常数( 也称结合 常数) ，k 2 是活化络合物的解离常数，k 吐是电子传递速率常数。这样，总的电 子传递过程实际上是由受不同因素影响的三个步骤调控的。 对于一个基元反应来说： k = a e 。6 e 8 ，r t 在一定温度下，反应速率由指前因子a 和活化能e 。决定。在生物电子传递体 系中，a 不是简单的碰撞频率，而是与前体复合物中电子给体和受体电子波函数 轨道重叠相关的项。指前因子a = 2 7 ch a b1 2 h 2 c o ；2 zh a s1 2 4 t l r t 。1 8 ，h a s 为电子给体和受体的轨道偶合常数，一般取决于给体与受体分子中心间的距离r ， 但与介质的性质无关。在最优化的重叠条件下( 近似范德华接触) ，a = 1 0 ”s 一， 并随距离呈指数衰减，ao c e - 1 3 。 衰减指数b 与周围的介质的性质相关，一般情 况下b = 1 2 o 3 a 。此体系的活化能e 。被简化为e 。= ( g o 一九) 2 4 九。 九是电子传递过程的分子重组能，由九i 衄c ，和九。u 。两部分组成。沁。对应于电子 传递前后，电子给体、受体内部构象调整所需要的能量； k 一对应于外部溶剂 分子定向极化作用的能量变化。综合以上条件，即得到m a r c u s 电子传递模型中 长程电子传递速率的表达式： k t = 2 7 t l h a b l 2 4 7 t l r t 1 彪e x p ( a g 。- 九) 2 4l r t 细胞色素b ，与细胞色素c 电子传递的研究 m a r c u s 提出的电子传递模型认为，电子传递反应速度取决于电子给体与受 体间的距离、反应自由能的变化以及反应物与周围溶剂重组能的大小，其核心内 容是活化能与反应的驱动力g 和介质的重组能九的相关性。图l 示意了电子传 递反应终态与始态势能面交叉点的位置随着反应自由能变化g 值的降低，逐渐 下降，但当g 降到一定值时，交叉点的位置又升高。因此，它预示着电子传递 反应速率随g 的降低会相应的先增快后减慢，整个过程呈抛物线形，其减慢部 分对应于m a r c u s 理论中的电子传递反转区( m c l e n d o ne t a l ，1 9 9 2 ) 。 咝。 f i g u r e1 t h er e g i m e sf o re l e c t r o nt r a n s f e r ：( a ) a g o 九，w i t hi n c r e a s i n gd r i v i n g f o r c ea l li n c r e a s i n ga c t i v a t i o ne n e r g yi so b s e r v e d ；a n d ( d ) ap l o to fa g o v sl o gk t p r e d i c t e db yt h e m a r c u st h e o r y ( a d 印m df r o mm c l e n d o ne ta 1 ，19 9 2 ) 2 生物体系中的电子传递 既然电子可以在有限的空间诸如细胞中进行长程传递( 1 0a 一3 0a ) ，但为 什么又只能在蛋白分子组成的电子传递链上逐级传递，而不能通过捷径快速地达 到平衡呢? 这是因为蛋白分子间须通过特定的识别形成复合物。帮助了氧化还原 细胞色素b j 与细胞色素c 电子传递的研究 蛋白实现生理上的选择性。蛋白的氧化还原活性中心被包裹在肽链的基质中，形 成特定的表面构象，只允许正确的电子传递伙伴之间的识别结合。虽然整个蛋白 质分子并不都是电子传递所必需的，但是相对于无选择性的小分子氧化还原中 心，肽链为电子传递提供了极为重要的反应选择性。 例如细胞色素c 过氧化物酶，其活性基团( f e ( i v ) o ) 氧化还原电位为1 0 v ， 可以与细胞中很多组分反应，但是它却专一性地与细胞色素c 反应。我们比较了 细胞色素c 过氧化物酶与细胞色素c 和非专一性的小分子f e ( c n ) 6 4 的反应， 它 与后者的反应是简单的碰撞机理。首先假设细胞色素c 和f e ( c n ) 6 4 的浓度都是 1 0 4 m 。细胞色素c 过氧化物酶与f e ( c n ) 6 4 的二级速率常数高达1 0 6m 1 s 一，但是 在1 0 4 m 浓度下，其拟一级速率也只是1s 。而细胞色素c 过氧化物酶与细胞色 素c 结合常数约1 0 。7m ，即使细胞色素c 的浓度是1 0 4m ，所有的细胞色素c 都是与细胞色素c 过氧化物酶结合的。假定g = 0 8e v ，九= 1 2e v 以及r = 1 6 a ， 根据m a r c u s 理论计算得到电子传递速率常数为1 0 3s - 。细胞色素c 过氧化物酶 与细胞色素c 的电子传递与纯粹碰撞反应的f e ( c n 0 6 4 相比要快1 0 0 0 倍，实现了 反应的选择性。值得一提的是，假定蛋白质分子复合物的形成是扩散控制的，且 电子传递在蛋白质分子结台的情况下才发生，则要求复合物的稳定存在时间必须 比电子传递所需的时间长。但是复合物如果太稳定，电子传递以后难以解离，也 会对反应不利。因此，最佳的蛋白质分子复合物的结合常数为1 0 7 m 。左右 ( m e l e n d o ne la t ，1 9 9 2 ) 。 3 蛋白质分子之间长程电子传递的实验研究 由于大部分的蛋白质分子复合物难以得到晶体结构， 电子传递研究的着眼 点是通过单个蛋白质分子的晶体结构数据拟合得到复合物的理论模型， 并预测 蛋白分子之间的结合行为和电子传递的速率，继而设计实验加以验证。蛋白分子 复合物的模型及其稳定性的大小可以用多种技术来验证，如紫外一可见光谱， 红外光谱，核磁共振光谱，时间分辨和稳态的荧光淬灭，化学修饰和基因工程的 突变技术等等。电子传递动力学过程的研究可根据反应速度的快慢分别采用稳态 ( 秒一分钟) ，快速停流( 毫秒一秒) 和激光闪光光解( 微秒一毫秒) 等动力 学方法。 在过去的二、三十年中，已有多个蛋白质电子传递体系得到了广泛而深入的 研究，如细胞色素c 过氧化物酶，细胞色素c ( n o c e k e la 1 ，1 9 9 6 ) ，细胞色素c ，细胞色素b 2 ( m c l e n d o n e la 1 ，1 9 8 7 ) ，细胞色素c ，细胞色素b 5 ( m c l e n d o ne t 口，1 9 8 5 ) ，肌红蛋白细胞色素b j ( l i a n ge t a l ，2 0 0 2 ) ，细胞色素如细胞色 素b j 还原酶( s t r i t t m a t t e r e l a t ，1 9 9 0 ) 等等。这些研究结果表明，m a r c u s 理论可 以对蛋白一蛋白电子传递反应的描述是合理的。通过一些电子传递复合物分子 细胞色囊b 与细胞色素c 电子传递的研究 内的电子传递研究，发现了氧化还原活性中心之间的距离与电子传递速率确有相 关性。在电子传递步骤为决速步骡的前提下，热力学的驱动力与电子传递速率之 间也有很好的相关性。大部分的电子传递体系没有表现出m a r c u s 的电子转移反 转区的动力学特点，这可能是由于蛋白分子的电子传递体系重组能比较高，体系 没有这么大的驱动力到达m a r c u s 的反转区，或者在驱动力比较大的情况下，构 象的调整成为了限速因素。 二 细胞色素如和细胞色素c 的电子传递过程研究 1 9 8 1 年b e m a r d i 等人( b e m a r d ia n da 7 _ , z o n e , 1 9 8 1 ) 发现，在线粒体内细胞 色素以和细胞色素c 是生理上的电子传递伙伴。由于这两个蛋白的兰维结构已 知，同时又较易获得大量的蛋白，所以这一体系成为人们研究蛋白质电子传递的 理想对象。最近的研究结果表明，细胞色素如和细胞色素c 的相互作用很可能 在细胞凋亡途径中起一定的调节作用( d a v y d o v ， 2 0 0 1 ) 。一般认为，线粒体释 放出来的细胞色素c 与凋亡促进因子( a p a f 1 ) 胱东肽酶( c a s p a s e 一9 ) 复合 物的相互作用诱导了凋亡途径。由于细胞色素如和细胞色素c 之间很强的结合 能力，细胞色素c 被释放出来后可能先与细胞色素幻结合，暂时阻碍了凋亡途 径，同时阻止了细胞色素p 4 5 0 和细胞色素以的作用，导致了活性氧的产生。这 一系列变化最终导致了线粒体基质膨胀和外膜的破裂，释放出更多的细胞色素c ， 放大了凋亡途径。因此，细胞色素幻和细胞色素c 相互作用研究，有着重要的 学术价值。 1 细胞色素如( c y t b s ) 简介 细胞色素b 是一个含血红素的电子 传递蛋白，每个蛋白质分子含一个血红 素b 辅基。其基本生理功能是通过血红素 辅基铁离子价态的可逆变化， 在生物体 多个氧化还原体系中传递电子( l e m b e r g a n d b a r r e t t ，1 9 7 3 ) 。它与黄素蛋白n a d h 细胞色素b j 还原酶或n a d p h 细胞色素 p 4 5 0 还原酶一起，参与n a i 掰链中脂肪f 迢竺2 8 1 7 ：竺d l a g r a m o f b o “。 酸去饱和。在红细胞与n a d h 细胞色素 如还原酶一起组成的还原体系中，将高铁血红蛋白还原为正常的血红蛋白，以保 证血红蛋白载氧功能的正常发挥。最近的研究进一步发现，细胞色素如通过和 细胞色素c 的的结合可能在细胞凋亡途径中起调节作用( d a v y d o v ， 2 0 0 1 ) 。 4 塑璺鱼茎坠皇塑塑垒童! 皇三堡望塑塑壅 i bp i _ l 123 4567891 01 11 21 31 4 1 5 5 55 65 75 85 96 06 16 26 36 46 56 66 76 8 6 9 * t h r g l u - a s p - p h e - g l u - a s p - 、，a l o l 仁h i s - s e r - t h r - a s p a l a a r g g l u 一， v - 、- | | i v 一一一一一一一一；如，一一一 1 1 ir 一， f 一p ：一一一一一f 8 48 38 28 18 0 7 97 87 77 67 57 47 37 27 17 0 a r g _ a s p - a s p - p r o - h i s - l e u g l u 母l 再i l e - i l e p h e - t h r - l y s - s e r - l e u - t 一一 v j l l 一 8 58 68 78 8 8 99 09 i9 2 9 3 一s e r l y s 一儿e t h r i s p r o s e r - g l u - s e r - c o o h 一一一一一j - j f i g u r e3t h ea m i n oa c i ds e q u e n c eo f b o v i n em i c r o s o m a ll b 5 t h ea h e l i c a ls e g m e n t s ( h ) ，r e g i o no fb - s h e e t ( b ) ，a n dt h ec o o r d i n a t i o no f t h eh e i n ei r o na r ei n d i c a t e d 牛肝微粒体细胞色素b j 是研究的相对比较充分的蛋白质之一，它是约含1 3 0 个氨基酸残基的膜结合蛋白。用脂肪酶( l i p a s e ) 消化可以得到9 3 个氨基酸残 基的含血红素的亲水结构域l b 5 ( l i p a s e s o l u b i l i z e dc y t6 5 ) ；用胰蛋白酶 ( t r y p s i n ) 消化可得到8 2 个氨基酸残基的含血红素的亲水结构域t b 5 ( t r y p s i n s o l u b i l i z e dc y tb 5 ) ，它们都具有与完整膜蛋白极为相似的生化功能。为 避免膜蛋白容易多聚的不利因素，大部分研究工作均用细胞色素b j 的水溶性结 构域片段代替完整形式的膜蛋白。 各种不同来源的微粒体细胞色素如及红细胞中的细胞色素西都有相当高的 同源性，尤其是它的活性部位及血红素结合部位的同源性高达9 0 以上 ( m a t h e w sa n dc z e r w i n s h i ，1 9 8 5 ；f u n ke ta 1 ，1 9 9 0 ；l l c i y de ta 1 ，1 9 9 4 ) 。1 9 7 2 年由 细胞色素6 j 与细胞色蠢c 电子传递的研究 m a t h e w s 等人首次报导了分辨率为2 8a 的牛肝微粒体细胞色素l b 5x 射线单晶 结构，随后又得到了分辨率更高的x 射线衍射单晶结构( m a t h e w se ta l ，1 9 7 2 a ； m a t h e w se ta l ，1 9 7 2 b ；d u r l e ya r i dm a t h e w s , 1 9 9 6 ；w ua n dh u a n ge la l ，2 0 0 0 ) 和核 磁共振研究的溶液结构( m u s k e t te ta l ，1 9 9 6 ；b a n c ie ta 1 ，1 9 9 7 ；a f i l e s a n oe ta l ， 1 9 9 8 ；b a n c i e t a l ，2 0 0 0 ) 。晶体结构表明，该蛋白包含了6 个泓螺旋、5 个b 折叠 和6 个转角，二级结构区域的代号在图3 中示出。多肽链的n 端1 1 2 和c 端8 8 - 9 3 氨基酸残基由于运动自由度过大， 在晶体结构的测量中不能精确地确定它们的 位置。 图2 是1 5a 分辩率的牛肝微粒体细胞色素t b 5 晶体结构( w ue ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 分子的高度大约3 7a ，截面的直径大约3la 。细胞色素t b 5 肽链组成两个疏水 结构核( f a l z o n ee ta 1 ，1 9 9 6 ；s t o r c ha n dd a g g e t t ，1 9 9 6 ) ，一个在分子的上半部分， 主要由四个口螺旋m 螺旋 m ，v ) 组成，被称为c o r e1 ，它的作用是通过与 血红素辅基之间的疏水相互作用，以及和h i s 3 9 和i - i i s 6 3 的轴向配位键的作用使 血红素辅基稳定，并且行使其电子传递的生物功能，所以c o r el 是该蛋白的功能 结构域。另一个在分子的下半部分，主要由五个1 3 折叠( p 折叠l ，2 ，3 ，4 ，5 ) 和a 螺旋i 及a 螺旋所形成，被称为c o r e2 ，它的作用是维持整个水溶性结构域 的稳定性。细胞色素如表面正负电荷分布极不均匀，分子的上半部分有1 1 个酸 性氨基酸残基和2 个碱性氨基酸残基，净电荷为- 9 ；分子的下半部分有7 个酸 性氨基酸残基和8 个碱性氨基酸残基，净电荷为+ 1 。这些结构特点与该蛋白的 生物功能密切相关。 2 细胞色素c ( c y t