2.2.1土壤中分解尿素的细菌的分离与计数课件.ppt

1、专题2 微生物的培养与应用,课题2:土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,【课题目标】,研究培养基对微生物的选择作用，进行微生物数量的测定。,【研究对象】,土壤中能分解尿素的细菌,【达到目的】,（1）从土壤中分离出能够分解尿素的细菌 （2）统计每克土壤样品中究竟含有多少这 样的细菌,一、 筛选菌株 （一）自然界中目的菌株筛选 原理：根据它对生存条件的要求，到相应的环境中去寻找 实例： PCR的自动化需要耐高温的 DNA聚合酶，这种酶要能忍受93左右的高温。 科学家从水生耐热细菌Taq中分离到耐高温的Taq DNA 聚合酶。 为什么Taq 细菌能从热泉中被筛选出来呢？ 因为热泉70-80的高温条件淘

2、汰了绝大多数微生物，而使耐高温的Taq 细菌脱颖而出。,【研究思路】,【研究思路】,（二）实验室中目的菌株筛选,原理：,人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、PH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。,回答： 1、在该配方中，为微生物生长提供碳源和氮源的是什么物质？ 2、绝大多数的微生物都能利用葡萄糖，但是，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，请分析该培养基是否对微生物有选择作用？如果有，是如何进行选择的？,葡萄糖、尿素,有选择作用，,选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。,【二、统计菌落数目】,常用方法：稀释涂布平板法、显微

3、镜直接计数法， 还可以用过滤膜法,1、稀释涂布平板法（也叫活菌计数法）,原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表 面生长的一个菌落，来源于样品稀释 液中的一个活菌，通过统计平板上的 菌落数，就能推测出样品中大约含有 多少活菌。,为了保证结果的准确，一般选择菌落数在30300的平板进行计数，若设置的重复组中结果相差太远，意味着操作有误，需重新实验。,计算公式： 每克样品中的菌落数=（某一稀释度下平板上生长的平均菌落数涂布平板所用稀释液体积）稀释倍数,设置重复组，目的是增强实验的说服力与准确性。将待测样品经一系列10倍稀释，然后选择三个稀释度的菌液，分别取0.1ml接种到已制备好的平板上，然后用无菌

4、涂布器将菌液涂布在整个平板表面，放在适宜的温度下培养计数菌落数。为是结果接近真实值，可将同一稀释度菌液加到三个或三个以上的平板上，经涂布培养，计算出菌落平均数,操作,2、显微镜直接计数法,（1）原理：此法利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物数量。 （2）方法：用计数板计数。计数板是特制的载玻片，其上有特定的面积为1mm2，高为0.1mm的计数室，一个计数室又被分成25个（或16个）中格，每个中格再被分成16个（或25个）小格，每个计数室都由400个小格组成。 （3）操作：将稀释的样品滴在计数板上，盖上盖玻片，然后在显微镜下计数45个中格中的细菌数，并求出每个小

5、格所含的细菌数，再按计数公式求出每毫升样品中所含的细菌数。 （4）计算公式 每毫升原液所含细菌数=每小格平均细菌数X400X10000X稀释倍数 （5）缺点：不能区分死菌与活菌。,3、过滤膜法,以测定饮用水中大肠杆菌的数目为例。将已知体积的水过滤后，将滤膜放在伊红美蓝培养液基上培养。在该培养基上，大肠杆菌的菌落呈现黑色。可以根据培养基上黑色菌落的数目，计算出水样中大肠杆菌的数量。,思考题,1.想一想，如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？,答：统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板菌落数的平均值，然后按课本旁栏的公式进行计算。,A同学的结果与其他同学不同，可能的

6、解释有两种。 一是由于土样不同； 二是由于培养基污染或操作失误。,三、设置对照 设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。,究竟是哪个原因，可以通过实验来证明。,另一种方案： 将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。,实验方案有两种,一种方案： 可以由其他同学用与A同学一样的土样进行实验，如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。,四、实验设计,实验的具体操作步骤如下: 1.土壤取样 2.制备培养基 3.微生物的培养与观察 4.细菌的计数,土壤中某样品细菌的分离与计数,操作提示,无菌操作 1. 取土样的小铁铲和盛土样的信封在使用前都需要灭菌。 2. 应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入烧瓶中，塞好棉塞。 3. 在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。,本实验使用的平板和试管比较多。为避免混淆，最好在使