《育种学》第十五章-转基因

第十五章转基因动物

转基因动物的制备转基因动物应用前景转基因动物研究存在的问题转基因动物：

应用实验胚胎学和分子生物学原理，将来自一种生物的特定基因导入另一动物的受精卵或早期胚胎细胞中，使其整合到宿主染色体中，在动物发育过程中表达，并能通过生殖细胞传递给后代。这种在基因组中稳定地整合有导入的外源基因的动物称转基因动物(transgenicanimal)。应用：

利用转基因技术

建立人类疾病动物模型加速动物育种研究真核生物基因表达调控机理在哺乳动物特异组织系统内生产药用蛋白等。进展

20世纪70年代，Jaenish和Mints应用显微注射法，首次获得了SV40DNA转基因小鼠。

1982年，Palmiter等将大鼠的生长激素基因导入小鼠受精卵的雄原核中，获得了比普通小鼠生长速度快24倍、体型大一倍的转基因超级小鼠(supermouse)。在随后的十几年里，转基因动物技术飞速发展，转基因免、转基因羊、转基因猪、转基因牛、转基因鸡和转基因鱼等陆续育成。这些开创性的工作，使人们在不同层次和不同角度立体地研究基因的功能，有目的地改良动物品种，为畜牧和水产养殖业服务。第一节转基因动物的制备

目的基因的来源目的基因导入

转基因胚胎培养与移植

转基因动物鉴定

一、目的基因的来源采用限制性内切酶，从生物组织中获取目的基因；通过mRNA合成cDNA；人工合成的DNA片段；聚合酶链式反应（PCR）扩增特定基因片段。二、目的基因导入把目的基因成功地导入动物早期胚胎细胞中，是转基因动物研究的核心技术。目前导入目的基因的主要方法有：电穿孔法显微注射法裸露DNA直接注射磷酸钙—DNA共沉淀法脂质载体包埋法病毒介导的生物学方法利用脉冲电场提高细胞膜的通透性，从而使外源DNA转移至细胞中。此法简单、效率较高，广泛应用于培养细胞的基因转移。电穿孔法实现外源基因的转移利用显微操作技术转移外源基因的方法。此法转入基因长度可达数百kb；并能随机地整合在受体细胞染色体DNA上，因此应用范围广。但是这种整合有时会导致转基因动物基因组的重排、易位、缺失或定点突变。显微注射转基因技术这种方法是受二价金属离子能促进细胞吸收外源DNA的启发而发展起来的。当核酸以磷酸钙—DNA共沉淀物的形式在时，细胞摄取DNA的能力显著加强。但转移效率较低，仅有1%~5%的外源DNA可以进入受体细胞核中，大约仅有1%的DNA可以在细胞中稳定表达。磷酸钙—DNA共沉淀法基因转移技术将需要转移的外源DNA或RNA包裹于脂质体内，由于脂质体具有磷脂双层结构，与细胞膜类似，因此可以与受体细胞膜融合，从而将外源DNA转入宿主细胞。这种方法转基因效率高。脂质载体包埋法病毒介导的生物学方法基因显微注射法反转录病毒法胚胎干细胞移植精子载体法核移植法受体介导的基因转移等三、转基因动物的方法何为显微注射？

显微注射就是借助光学显微镜的放大作用，利用显微操作仪，直接把DNA注射到动物早期胚胎、胚胎干细胞、体细胞或卵母细胞中，然后生产动物个体的技术。经过显微注射DNA发育而成的动物中，有少数整合了被注射的DNA分子，成为转基因动物。（一）基因的显微注射法

转基因鱼的制备

与哺乳动物不同，鱼类为体外产卵、体外受精和体外发育，因而不需要剖腹取卵和将转基因胚胎再移植到假孕养母子宫内等复杂的操作步骤。采用显微注射法将外源基因导人金鱼卵母细胞生发泡制备转基因金鱼的操作过程如下：①注射用针的制作：取直径1mm的毛纫玻璃管，在拉针仪上制备直径小于10um的毛细玻璃针，用于显微注射；②DNA溶液的配制：用Holtfreter液（每升蒸馏水中溶解3.5gNaCl、0.5gKCl、0.1gCaCl2、0.2gNaHCO3)配成终浓度约40ng/uL的DNA溶液；③卵母细胞的收集和体外培养：取雄鱼追逐的雌鱼，剖腹取卵巢，将分散好的卵母细胞用1ug／mL的17α—20β—二氢孕酮溶液于24℃处理1h以上，待生发泡移至动物极受精孔下方时，即可注射；④显微注射：注射几皮升至几十纳升的DNA溶液，大约相当于104一107个基因拷贝。注射外源DNA的量太大对胚胎有毒性，太少则影响基因的整合率。⑤注射后卵母细胞的培养：于24℃培养约3h后，生发泡破裂，再继续培养8—9h后即可进行人工受精；⑥人工受精：用尖头镊子去除卵母细胞的滤泡细胞后，立即加入精液受精；⑦胚胎的培养：受精卵孵化成幼鱼，继续培养：⑧转基因鱼的鉴定（二）胚胎干细胞方法胚胎干细胞（embryonicstemcell，ES）是从早期胚胎内细胞团（ICM）分离出来的，能在体外培养的一种高度未分化的多能干细胞。它是一种含正常二倍体染色体的具有发育全能性的细胞。可以在体外进行人工培养，扩增，并能以克隆的形式保存。通过胚胎干细胞获得转基因小鼠优点：基因转移效率大大提高，且能进行定位基因转移。缺点：需要多代才能得到纯合的转基因动物，这对饲养成本高，产仔数较少的大型哺乳类动物来说，要获得转基因动物是一件需要大量资金投入的事情。（三）反转录病毒感染法

利用反转录病毒作为目的基因的载体，通过感染宿主细胞实现基因转移，产生嵌合体动物，再经过杂交、筛选即可获得转基因动物。1、反转录病毒感染法的原理通过反转录病毒载体获得转基因小鼠2、反转录病毒感染法的载体的构建提取病毒未整合的环状形式DNA；将环状DNA克隆到适当的载体中；选择适当的酶将病毒结构蛋白编码区切除；将外源目的基因克隆到载体中3、通过物理方法将重组DNA分子转入包装细胞

反转录病毒载体的工作原理：寄生在受体细胞中的重组病毒由于没有包装信号，能生产病病毒RNA和所有蛋白质，但不能包装成病毒颗粒；病毒载体转化受体细胞后，载体上的包装信号将使包装蛋白把载体包装成为侵染生的病毒颗粒。重组反转录病毒感染早期胚胎优点：能有效地将转基因整合入受体细胞的基因组内，单拷贝整合型；转基因整合后能稳定地遗传；整合机制相应明确，在TR区域内进行，不会破坏转基因结构缺点：载量较小，一般只有8kb，可能会因缺少必须的调控元件而影响转基因表达；尽管病毒载体被设计为复制缺陷型的，但在包装细胞的包装过程中，若与整合型辅助表达基因组发生同源重组，就有可能组装成野生型逆转录病毒颗粒，因此在构建具有商业价值的转基因动物时，一般使用受到限制。操作繁琐。（四）精子载体法

此法是通过精子吸附DNA，再通过受精作用把目的基因传给子代动物，从而获得转基因动物。1989年，Arezzo用吸附有外源基因氯霉素乙酰转移酶基因的海星精子与卵子受精，将外源基因整合到受精卵中，并发现氯霉素乙酰转移酶基因在胚胎内获得表达。同年，Lavitrano等利用鼠附睾内的精子进行实验，获得相似结果。该法操作简便，生产成本低，在大规模生产上的应用前景好。精子吸附DNA的方法主要有DNA与精子共育法、电穿孔导入法和脂质体转染法三种。DNA与精子共育法中，DNA吸附到精子上的水平较低，但外源基因的整合率较高，可达50％；电穿孔法中，精子吸附DNA的水平较高，但外源基因的整合率很低，这可能与电穿孔后精子顶体遭到破坏有关；脂质体转染法所获得的受精卵存活力较高，外源DNA的整合率也较高。精子吸附外源DNA后，就可利用其进行受精。受精的方法及途径因精子的处理方式及卵的来源不同而有所不同，主要包括人工受精、输卵管壶腹部手术受精和体外受精等。

1999年，Anthong等报道了一种新的方法，即首先将精子与外源基因共孵育lmin，然后将精子的头部显微注入MII期的小鼠卵母细胞中，后代的转基因阳性率可达20％以上。研究发现，精子膜的破损更有利于转基因动物的获得。（五）受体介导法

早期胚胎中有胰岛素及胰岛素样生长因子IGFI和IGFⅡ表达，外源性胰岛素促进细胞增殖及胚胎形态发生；而且早期胚胎细胞内存在胰岛素受体，使受体介导的基因转移成为可能。1999年，IvanvaM．M．构建了一个同时携带有胰岛素--多聚赖氨酸基因的重组体。将兔与鼠的胚胎与该重组体共同培养3h，显微镜下观察到该重组体穿过了透明带在卵裂球核旁区聚集。印迹杂交显示，12d和15d鼠胚和一个新生鼠的基因组内均有外源DNA的整合、表明受体可以介导外源基因进入早期哺乳动物胚胎中。对早期胚胎进行遗传操作所遇到的一个重要问题是实验操作对胚胎的损伤和实验中所用成分对胚胎的毒性。该法采用胰岛素作为介入体，优点在于不需显微操作，而且使用的运载工具对胚胎无明显毒害作用，为将来的基因治疗提供了一条新途径。转基因胚胎培养与移植

在制备转基因哺乳动物时，处理完毕的转基因受精卵或胚胎，经过短期的体外培养，就可移植到假孕动物的输卵管中进行发育，或培养到2细胞或胚泡期再进行移植。小鼠的受精卵经过显微注射后，如果卵周隙清晰可辨，则表明注射是成功的；反之，注射失败的受精卵，则质膜破裂，卵周隙不清楚。一般情况下，受精卵注射的成功率应保持在50％--80％或以上。四、转基因动物鉴定

待测组织的取材

对于胚胎组织，取胎儿鼠臀部肌肉提取DNA，取其他组织提取RNA。所取组织均应置于-70℃冰箱或液氮中保存。牛可取60--65d胎儿的组织，小鼠可取出生2--3周后的幼鼠尾巴。样品DNA的抽提取胎鼠肌肉或幼鼠1.5—2.0cm长的尾巴，在试管中用小剪刀将其剪碎，加入裂解液和蛋白酶K进行消化，消化后加40uLRNA酶，于37℃下消化l--2h。加入等体积的酚--氯仿--异戊醇(酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1)抽提，酒精沉淀，用TE缓冲液溶解沉淀。DNA的提取斑点杂交和PCR扩增Southern杂交Northern杂交表达产的检测一、转基因动物研究现状（一）转基因牛①从屠宰场杀掉的奶牛体内收集卵母细胞，并使之在体外成熟⑦用公牛精液对成熟卵母细胞进行体外受精；②受精卵离心，浓缩卵黄；④将欲导入的DNA微注射到桔前核当中；⑤对胚胎进行体外培养；⑥利用非外科移植术将一个胚胎植入发情的代孕母牛子宫内；⑦对于代进行州A检测，确定是否存在转人基因。（二）转基因绵羊、山羊和猪在山羊奶中生产ATT（三）转基因禽类（四）转基因鱼二、转基因动物的应用（一）转基因动物在生命科学基础研究中的应用研究基因的结构与功能研究基因的组织特异性表达研究发育相关基因的表达与调控克隆在发育中起重要作用的基因基因多级调节系统的研究细胞功能研究基因敲除（geneknockout），是指对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因去除，或用其它顺序相近基因取代，然后从整体观察实验动物，推测相应基因的功能。这与早期生理学研究中常用的切除部分——观察整体——推测功能的三部曲思想相似。基因敲除的技术路线如下：

（1）构建重组基因载体﹔

（2）用电穿孔、显微注射等方法把重组DNA转入受体细胞核内﹔

（3）用选择培养基筛选已击中的细胞﹔

（4）将击中细胞转入胚胎使其生长成为转基因动物，对转基因动物进行形态观察及分子生物学检测。（二）转基因动物在医药研究领域中的应用研究病毒性疾病研究建立人类疾病的转基因动物模型转基因动物与基因治疗生产天然活性药物蛋白第三节转基因动物研究存在的问题转基因动物的低效性转入基因造成宿主基因突变问题转入基因的表达问题病毒转基因研究存在的问题转基因动物模型与预期不符问题乳腺生物反应器的问题社会问题动物生物反应器

一般把目的片段在器官或组织中表达的转基因动物叫动物生物反应器（bioreactor），几乎任何有生命的器官、组织或其中一部分都可经过人为驯化为生物反应器,从生产的角度考虑，生物反应器选择的组织和器官要方便产物的获得，例如，乳腺、膀胱、血液等，由此发展了动物乳腺生物反应器,动物血液生物反应器和动物膀胱生物反应器等。其中，转基因动物乳腺生物反应器的研究最为引人注目。一、动物血液生物反应器

外源基因在血液中表达的转基因动物叫血液生物反应器。大家畜的血液容量较大,利用动物血液生产某些蛋白质或多肽等药物己取得了一定进展。外源基因编码产物可直接从血清中分离出来,血细胞组分可通过裂解细胞获得。二、动物膀胱生物反应器

外源基因在膀胱中表达的转基因动物生物反应器,叫动物膀胱生物反应器。膀胱尿乳头顶端表面可表达一组尿血小板溶素的膜蛋白,这种蛋白在膀胱中表达具有专一性,而且它的基因是高度保守的,将外源基因插入5′端调控序列中,就可以指导外源基因在尿中表达。三、动物乳腺生物反应器

动物乳腺生物反应器利用哺乳动物乳腺特异性表达的启动子元件构建转基因动物,指导外源基因在乳腺中表达,并从转基因动物的乳液中获取重组蛋白。1.动物乳腺生物反应器的制备（1）表达载体的构建目前用于表达载体的启动子调控元件选用动物乳蛋白基因启动子元件，主要有四类乳腺定位表达调控元件：第一类是B2乳球蛋白(BLG)，第二类是酪蛋白基因调控序列：第三类是乳清酸蛋白(WAP)基因调控序列；第四类是乳清白蛋白基因调控序列。（2）目的基因的选择选择目的基因的基本要求是，正常情况下浓度低、翻译后修饰复杂、其它表达体系难以表达或表达量低、应用前景广阔的蛋白基因。（3）体外重组选择好目的基因和启动子调控元件后进行体外重组，构建融合基因。（4）基因转导将构建好的重组基因用基因转导方法转移到受精卵。（5）胚胎移植利用胚胎移植技术将制备的转基因受精卵植入待孕母体子宫内，生产转基因动物，得到转基因乳腺表达个体。通过采集转基因动物的乳汁,来获得目的基因表达产物。（6）鉴定转基因动物乳腺生物反应器可以从分子水平和乳腺分泌物两个方面进行鉴定。

2.动物乳腺生物反应器的优点产品质量稳定产品成本低研制开发周期短无污染经济效益显著3.动物乳腺生物反应器的应用高乳汁营养价值生产药用蛋白4.动物乳腺生物反应器存在的问题（1）外源基因在动物体内的位点整合问题（2）乳蛋白基因表达组织特异性问题（3）目的蛋白的翻译后修饰问题（4）转基因表达产物的分离和纯化问题（5）转基因的技术与方法问题（6）伦理道德问题举例1、药用蛋白的生产2、进行基因治疗

基因治疗是通过调控目的基因的表达，抑制、替代或补偿缺陷基因，从而恢复受累细胞、组织或器官的生理功能。β-地中海贫血是一种因为基因突变导致红细胞中β-珠蛋白链不足而产生的贫血，小鼠Hbbd含有两种成年型珠蛋白(βmaj和βmim)，基因突变导致βmaJ基因缺失时，其纯合突变体则表现出与人类β-地中海贫血相似的症状。将小鼠或人的β-珠蛋白基因注入纯合突变体的小鼠受精卵中，使小鼠的贫血得到了纠正，这表明用转基因动物技术对遗传病进行生殖细胞的基因治疗是完全可能的。

3、在人类组织器官移植中的应用

医学上的异种器官移植，排异反应迅速而剧烈。人类间的器官移植，虽然排异反应可被药物控制，但可供移植的器官严重缺乏。于是人们就想可否应用异种动物的器官组织进行移植，但必须克服异种间剧烈的排异反应。目前，排异反应的机理已基本搞清楚。主要是人的器官组织中糖蛋白的决定簇与猪、羊、狗、牛等动物不同。这些动物的血管内皮上的糖蛋白有一个α-1，3-半乳糖，同时还有一个α-1，3—岩藻糖，而人体内有天然的抗α-1，3半乳糖抗体，在用这些动物对人进行器官移植时，天然的抗体与这些动物含α-l，3半乳糖的抗原结合，形成抗原抗体免疫复合物，激活补体系统．损坏器官内皮和基底膜，使渗透性增加、出血，导致器官组织坏死而排斥这种器官，而且这种反应可在几分钟到几小时内出现。

为了解决异种移植的排斥反应，学者们提出两条途径：一、清除受体动物血中的特定补体，使供体器官不受补体攻击。利用这种办法，使猪的心脏移植于猴体内，可以延长心脏存活的时间；二、采用转基因技术，通过克隆受体的补体调节蛋白基因，将这种基因转移到供体动物的基因组中，使其在心血管内皮表达，以避免受体的排斥反应。

在可用于人器官移植的动物中，除灵长类外，猪是最为理想的供体，因为猪的器官，特别是心、肾的大小和结构与人类相似，生理指标接近，血型抗原也与人的相似。科学家己获得补体活性调节剂，用于人体接受猪心脏的器官移植中。

1993年，英国已培育出37头含人体基因的猪，培育出携带人体免疫系统的猪心脏，移植到猴体内，心跳可持续60d，具有较好的安全性。目前正在准备向人体移植，前景美好，方法可行。我国目前也在投入人力物力研究培育这种转基因猪。还有人已将携带人类基因的猪心脏移植到猕猴体内，也度过了超快排斥阶段。可见，将猪心脏移植到人体内，以挽救濒危心脏病人，不久也将成为现实，但需克服病毒交叉感染等问题

4、病毒性疾病的研究

把病毒基因导入动物并制成转基因动物，可研究这些病毒基因在宿主动物引起的病理变化，从而探讨其发病机理和治疗路线。这是转基因动物技术提供的又一条独特的实验体系。乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)是引发乙型肝炎的病原体，但HBV一般不感染培养细胞，也不感染常用的实验动物，因而限制了其致病机理的研究。然而将HBV基因或其片段导入鼠体内，获得的转基因鼠产生肝脏病变并最终导致肝癌。在脊髓灰质炎病毒(PVR)受体转基因鼠中，PVR在中枢和外周神经系统及胸腺内发育的T淋巴细胞和肾上皮细胞中，均有高水平的表达。接种脊髓灰质炎病毒后，除在脑神经元和脊髓外，还在骨骼肌中检出病毒的复制，说明脊髓灰质炎病毒受体的表达是决定该病毒宿主范围的重要因子。此外，转基因技术也已应用于人嗜T淋巴细胞病毒I型和Ⅲ型的研究，成为人们了解T淋巴细胞白血病和艾滋病的工具之一。5、建立人类疾病的转基因动物模型

理想的动物模型，可以模拟人类疾病的发生和发展过程，并为测试各种可能的治疗方案提供一个统一有效的系统。随着现代医学技术的发展，传统的传染病已逐渐减少，而遗传性疾病的研究和治疗越来越显得迫切和重要了。转基因动物技术被认为是遗传学研