《污水中猪蓝耳病病毒的快速筛查RT-PCR法》编制说明

一、项目来源

根据《广西标准化协会关于下达2023年第四十一批团体标准制

修订项目计划的通知》（桂标协〔2023〕140号）文件精神，由南宁

壮博生物科技有限公司、广西扬翔股份有限公司、金陵农牧集团有限

公司、巨星农牧有限公司、深圳市京基智农时代股份有限公司、济凡

生物科技（常州）有限公司、广西农业职业技术大学等单位共同起草

的团体标准《污水中猪蓝耳病病毒的快速筛查RT-PCR法》（项目编

号：2023-4102）获批立项。

二、项目背景及目的意义

农业部关于印发《国家高致病性猪蓝耳病防治指导意见（2017—

2020年）》的通知指出，各地要加大疫情监测力度，及时准确掌握病

原分布和疫情动态，科学评估发生风险，及时发布预警信息。要选择

一定数量的养殖场户、屠宰场和交易市场作为固定监测点，持续开展

监测。

2021年，农业农村部关于印发《非洲猪瘟等重大动物疫病分区防

控工作方案（试行）》的通知指出，强化技术支撑，及时通报和共享动

物疫病检测数据和资源信息，推动检测结果互认。完善专家咨询机制，

组建大区重大动物疫病防控专家智库，定期组织开展重大动物疫病风

险分析评估，研究提出分区防控政策措施建议。

猪蓝耳病是常见于家猪和野猪群体间的传染性疾病，因其可通过

直接接触在群体之间传染，因此这种疾病的出现对我国的养猪业带来

了极大的影响。猪蓝耳病又称猪流行性流产和呼吸综合征。此种疾病

传染不但会威胁猪的健康，还会影响母猪的繁殖，造成流行性流产情

况的发生。

广西开展猪蓝耳病病毒检测，主要进行检测的场所包括猪场种畜

场等，其中分布在南宁壮博生物科技有限公司、金陵农牧集团有限公

司种畜场、京基智农种畜场、巨星农牧种畜场等场所。

2022年7月3日，华南地区某生猪养殖场采集15个养殖单元的

污水样品；2022年12月1日，华南地区某生猪养殖场采集2个养殖

单元的污水样品；2022年12月6日，华南地区某生猪养殖场采集6

个养殖单元的污水样品；2022年12月15日，华南地区某生猪养殖

场采集2个养殖单元的污水样品；2023年1月12日，华南地区某

生猪养殖场采集1个养殖单元的污水样品；2023年2月9日，华南

地区某生猪养殖场采集3个养殖单元的污水样品，分布进行猪蓝耳病

病毒检测，均检测出阳性。经污水检出阳性后对养殖单元内进行个体

观察和采集唾液拭子到实验室进行核酸检测，部分猪存在发热、精神

沉郁、咳嗽、食欲不振现象，存在有蓝耳病的病症，实验室也在采集

的唾液拭子中检测出阳性。

在感染猪蓝耳病后，猪的生殖能力受到了很大限制。公猪在感染

猪蓝耳病后一般不会有明显的症状出现，有少数公猪会伴有发烧、食

欲减退、精液量减少的情况发生。相对于公猪感染的反应，母猪感染

后症状更明显，会突然放弃进食，并伴有嗜睡的情况出现，对于已经

怀孕的母猪来说，会出现严重的流产情形。母猪在怀孕初期因为胚胎

的保护作用，可对此种病毒有效的进行阻隔，但在母猪的怀孕后期，

由于自身抵抗力下降导致感染病毒的几率增强，引发母猪早产、流产

以及胎死腹中的情形发生。

由于母猪在妊娠过程中抵抗力的下降导致感染率增加，造成幼猪

的死广率明显增高，很多幼猪在没有出生前便胎死腹中，即使母猪顺

利的生产，也会造成幼猪身体素质差且伴有呼吸困难的症状，同时幼

猪的身体较弱容易引发其他疾病从而造成幼猪的死亡。育肥猪在感染

猪蓝耳病后生长速度缓慢，营养无法吸收导致体重增长迟缓，并会陆

续发生死亡的现象，给养猪者带来严重的经济损失。

与常规PCR检测方式相比，以10%抽样，5:1混检，试剂盒费用

80元为例，10000头猪进行一次抽检的费用是1.6万元。假如每周抽

检一次，即一年抽检52次，全年的检测费用为83万元，平均83元/

头。根据石家庄市动物疫病预防控制中心2022年8月的招标成交公

告显示，采用荧光定量PCR方法检测3500头猪，中标检测费用为

591150元，折合169元/头。2021年该项目中标单价为180元/头。

污水监测费用是常规抽检荧光定量PCR的10%，大大减少了成

本。污水检测发现阳性后，及时定位养殖单元，对养殖单元内进行个

体观察和检测，可实现早发现、早防控。建立全时段的防疫体系，实

现低费用、高效率的疫情预警及防控。

因此，通过制定团体标准《污水中猪蓝耳病病毒的快速筛查

RT-PCR法》，以标准为抓手，统一规范污水中猪蓝耳病病毒快速筛查

的检测技术，为猪蓝耳病的预防、监测提供重要依据。

三、项目编制过程

（一）成立标准编制工作组

团体标准《污水中猪蓝耳病病毒的快速筛查RT-PCR法》项目

任务下达后，南宁壮博生物科技有限公司牵头组织成立了标准编制工

作组，制定了标准编写方案，明确任务职责，确定工作技术路线，开

展标准研制工作，具体由南宁壮博生物科技有限公司、广西扬翔股份

有限公司、金陵农牧集团有限公司、巨星农牧有限公司、深圳市京基

智农时代股份有限公司、济凡生物科技（常州）有限公司、广西农业

职业技术大学相关人员配合。

（二）收集整理文献资料

标准编制工作组收集了国内有关污水中猪蓝耳病病毒快速筛查的

相关技术文献资料。主要有：

GB19489-2008实验室生物安全通用要求

GB/T35912-2018猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光RT-PCR检测

方法

WST799-2022污水中新型冠状病毒富集浓缩和核酸检测方法

标准

DB45∕T2138-2020水体中诺如病毒的核酸检测方法实时荧光

RT-PCR法

专利《用于检测猪蓝耳病病毒的富集浓缩试剂盒》

（三）研讨确定标准主体内容

标准编制工作组在对收集的资料进行整理研究之后，标准编制工

作组召开了标准编制会议，对标准的整体框架结构进行了研究，并对

标准的关键性内容进行了初步探讨。经过研究，标准的主体内容确定

为原理、试剂和材料、仪器设备、样品采集及前处理、实时荧光RT-PCR

检测、结果评价、检出限。

（四）调研及形成草案、征求意见稿

2023年7月，在前期工作的基础之上，通过理清逻辑脉络，整合

已有的参考资料中有关污水中猪蓝耳病病毒的快速筛查RT-PCR法的

要求，并结合污水中猪蓝耳病病毒的快速筛查RT-PCR法实际要求的

基础上，按照简化、统一等原则编制完成团体标准《污水中猪蓝耳病

病毒的快速筛查RT-PCR法》（草案）。

2023年8月-10月，标准编制工作组对前期的研究和数据进了整

理并结合前期技术咨询会、征求意见会的内容针对污水中猪蓝耳病病

毒快速筛查进行多次讨论、研究，最终形成团体标准《污水中猪蓝耳

病病毒的快速筛查RT-PCR法》（征求意见稿）和编制说明。

四、标准制定原则

（一）实用性原则

本文件是在充分收集相关资料和文献，分析污水中猪蓝耳病病毒

的快速筛查当前现状，调研污水中猪蓝耳病病毒的快速筛查的分析方

法情况，在现有国家、行业标准相关污水中各种病毒测定方法要求的

基础上，结合多年经验而总结起草的。符合当前使用RT-PCR法测定

污水中猪蓝耳病病毒的方向与需求，有利于行业的长远发展，具有较

强的实用性和可操作性。

（二）协调性原则

本文件编写过程中注意了与污水中猪蓝耳病病毒的测定相关法律

法规的协调问题，在内容上与现行法律法规、标准协调一致。

（三）规范性原则

本文件严格参照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：

标准化文件的结构和起草规则》的要求和规定编写本标准的内容，保

证标准的编写质量。

（四）前瞻性原则

本文件在兼顾当前区内采用污水中猪蓝耳病病毒的快速筛查现实

检验情况的同时，还考虑到了污水中猪蓝耳病病毒的测定方法快速发

展的趋势和需要，在标准中体现了个别特色性、前瞻性和先进性条款，

作为对污水中猪蓝耳病病毒快速筛查的指导。

五、标准主要章节内容及确定依据

团体标准《污水中猪蓝耳病病毒的快速筛查RT-PCR法》主要

内容包括原理、试剂和材料、仪器设备、样品采集及前处理、实时荧

光RT-PCR检测、结果评价、检出限。

（一）原理

参考DB45∕T2138-2020《水体中诺如病毒的核酸检测方法实时

荧光RT-PCR法》。向污水中加入富集浓缩试剂，富集浓缩试剂可使

病毒颗粒形成多聚体，通过离心作用将水溶液与病毒颗粒多聚体分开，

收集病毒颗粒多聚体形成的沉淀，采用核酸提取和实时荧光RT-PCR

检测。

（二）试剂和材料

除另有说明外，所用试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682

中一级水的要求。

用到的试剂和材料有：磷酸盐缓冲液（1mol/LPBS，pH值7.2）、

富集浓缩试剂、病毒核酸提取试剂盒、无核酸酶水：分子生物学级、

离心管（1.5mL、50mL）、无菌移液器吸头（10μL、200μL、1mL，

带滤芯，无核酸酶）、无菌聚乙烯瓶、透明薄壁PCR管（0.2mL）。

仪器设备：冰箱（0℃～20℃）、电子天平（精度0.01g）、高速

台式冷冻离心机（可控温至-4℃，离心速度≥13000g）、低速离心

机（离心速度12000r/min）、金属水浴锅、振荡混匀器、高压灭菌器、

实时荧光PCR扩增仪、二级生物安全柜。

（三）样品采集及前处理

水样采集、运送和保存：

根据采样场所排水系统分布情况，重点选取污水排水口、内部管

网汇集处等关键位置，对未经消杀处的污水进行采样。根据现场条件

和检测需求确定水样采集方式，如瞬时水样或混合水样。用无菌聚乙

烯瓶采集污水样本，采样体积为200mL～300mL。样本采集后，应

在现场使用75％酒精对采样瓶外表面进行消毒，并及时将样本送至实

验室，运输过程中水样温度保持在0℃～4℃。实验室接到水样后应

尽快进行检测，如未及时检测，应将水样置于-4℃冰箱保存待检。

对比其它行业标准中离心温度是4℃，本标准是-4℃，因为病

毒会在低温下生存，不会冻死，低温下停止活动并进入休眠状态。大

多数病毒耐低温，但不耐高温，在低于0℃的温度下可以存活很长时

间并保持其传染性，用-4℃离心能确保病毒的活性。

病毒富集浓缩：

病毒富集浓缩是本标准中较为关键的步骤，具体提操作如下：

——将污水样品混合均匀，取同一厂各3管40mL的污水分别置

于3个50ml离心管中，在-4℃、2500r/min的条件下离心30min。

剩余污水样本作为备份。

——将7.2.1中所得上清液分别转移至试剂盒提供的预混试剂离

心管中，充分混合，震荡摇匀30min。

——在-4℃、12000r/min的条件下离心120min，离心机降速

时不应使用制动力。将离心管从离心机上取出，倾倒并弃除离心管中

的上清液，至无上清液倒出。该过程需减少沉淀的溶解与损失，以提

高病毒浓缩富集效率。

——在-4℃、12000r/min的条件下离心5min，离心机降速时

不应使用制动力。将离心管从离心机上取下，用移液器从每个离心管

中吸出剩余的上清液。注意避免吸管尖端接触沉淀。

——将200uL磷酸盐缓冲液（5.1）加入至离心管中，反复吹吸

沉淀，最终形成混悬液（该水样的浓缩液），同一厂3管污水悬混液合

为1管浓缩液。

——将浓缩液转移至1.5mL离心管中，于0℃～4℃条件下保

存，并于24h内完成核酸提取和扩增。

（四）实时荧光RT-PCR检测

核酸提取：

在二级生物安全柜中打开装有污水样本浓缩液的离心管，按照病

毒核酸提取试剂盒说明，取适量浓缩液进行核酸提取，提取完成后应

立即封盖并进行实时荧光RT-PCR检测。剩余的浓缩液和核酸样本应

于-4℃条件下冻存。

核酸扩增：

参照猪繁殖与呼吸系统综合征（蓝耳病）荧光PCR检测试剂盒

说明书（见附页）进行。每个样本设置3个平行。

（五）结果评价

阳性结果评价：

——阳性对照FAM通道与VIC通道Ct值均＜35且出现特异性扩

增曲线。阴性对照应无Ct值，且无特异性扩增曲线，试验结果有效；

否则应重新进行试验。

——FAM通道Ct值≤38且出现特异性扩增曲线，判定为病毒核

酸阳性。

——FAM通道Ct值38＜Ct≤45,判定为可疑，应对样本进行复测，

若复测结果Ct值仍在38～45之间有明显指数增长，则判定为阳性，

否则为阴性。

阴性结果评价：

——通道无Ct值或无典型S型扩增曲线，同时VIC通道CT值

＜38，判为阴性，表明样品中未检出病毒核酸。

——FAM通道无Ct值或无典型S型扩增曲线，同时VIC通道CT

值＞38或无CT值，则该样本检测结果无效，应重新安排采样检测。

（六）检出限

检出限按本标准的试验方法进行验证，选取10个空白平行样品，

通过分析，计算得出猪蓝耳病病毒的方法检出限为1copies/mL。具体

试验验证数据如下表所示：

广西农业职业技术大学检出限测试数据表

金陵农牧集团检出限测试数据表

广西扬翔股份检出限测试数据表

南宁壮博生物科技有限公司检出限测试数据表

（七）精密度

定性分析的精密度通常表现为假阳性或假阴性。依据RT-PCR法

进行测定，判断污水样品的测定结果为阴性或阳性。三家实验室的精

密度测试数据如下：

广西农业职业技术大学精密度测试结果

金陵牧业集团有限公司精密度测试结果

广西扬翔股份有限公司精密度测试结果

南宁壮博生物科技有限公司精密度测试结果

（八）实验室间方法确认

根据方法标准验证要求，选择3家实验室进行实验室间方法确认，

确认方法的“选择性”、“检出限”和“精密度”。

1、确定4家实验室参加。分别是广西农业职业技术大学、金陵牧

业集团有限公司、广西扬翔股份有限公司。

2、实验室方法确认的污水样品共7份（每家实验室的污水样品相

同），污水样品编号为01至07。

3、通过3家实验室的数据比对（验证方案见附页），4家实验室对

7份污水样品的判定结果一致。

通过以上实验数据，4家实验室都对方法的“选择性”、“检出限”、

“精密度”都进行了确认，说明污水中猪蓝耳病病毒的快速筛查

RT-PCR法可行、稳定，满足污水中猪蓝耳病病毒的快速筛查。

六、国内外同类标准制修订情况及与法律法规、强制性标准关系

经查阅，与“污水中猪蓝耳病病毒快速筛查”有关的标准有：GB/T

18090-2023猪繁殖与呼吸综合征诊断方法（即将实施）；GB/T

18090-2008猪繁殖与呼吸综合征诊断方法（现行）；GB/T

36875-2018猪瘟病毒RT-nPCR检测方法；GB/T34729-2017猪

瘟病毒阻断ELISA抗体检测方法；GB/T27540-2011猪瘟病毒实时

荧光RT-PCR检测方法；GB/T35912-2018猪繁殖与呼吸综合征病

毒荧光RT-PCR检测方法；NY/T3237-2018猪繁殖与呼吸综合征

间接ELISA抗体检测方法；DB33/T822-2010高致病性猪蓝耳病

RT-PCR检测技术；DB65/T3899-2016高致病性猪蓝耳病RT-PCR

检测方法；DB13/T5345-2021猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病

毒2型二重PCR检测方法；DB21/T2827.1-2017畜禽疫病防治与

净化技术规范第1部分：猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株与高致病性

变异株RT-PCR鉴别检测方法；DB21/T3257-2020猪繁殖与呼吸

综合征病毒抗体酶联免疫检测方法辽宁省市场监督管理局

2020-05-30现行；DB32/T3775-2020猪繁殖与呼吸综合征病毒

RT-LAMP检测方法；DB35/T1335-2013猪繁殖与呼吸综合征抗体

检测方法免疫金试纸法；DB35/T1852-2019猪繁殖与呼吸综合征

病毒实时荧光RT-PCR检测方法；DB37/T3085-2017高致病性猪

繁殖与呼吸综合征病毒株和经典毒株的RT-PCR鉴别检测技术；

DB45/T1010-2014美洲型及欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的检

测多重荧光定量反转录聚合酶链反应法；T/CVMA12-2018猪繁殖

与呼吸综合征病毒实时荧光RT-PCR检测方法；T/CVMA6-2018