苜蓿中转基因成分实时荧光PCR定性检测方法

苜蓿中转基因成分实时荧光PCR定性检测方法本标准规定了苜蓿中转基因成分检测的实时荧光PCR方法。本标准的筛选检测适用于苜蓿中转基因成分的定性检测本标准的鉴定检测适用于苜蓿J101、J163和KK179品系特异性定性检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(但括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求GB/T19495.3转基因产品检测核酸提取纯化方法GB/T19495.7转基因产品检测一下列缩略语适用于本文件ACC:乙酰输酶A羧化酶基因(acylCoAchtaxylasc)。CCOMT:来自紫花苜蓿的咖啡酰辅酶A3-0-甲基转移酶基因(CaffeoylCoA3-0-methyltransferasegenefronMedicaC值：每个反应管内商使光5到达设定的同值时所经历的循环数(Cyelethreshold)。CTP2:拟南芥EPSPS叶绿体码序列(chfomArabidopsisthalianaEPSE93':来源于腕豆核酮糖-1.5-二磷酸羧化菌3'终止子(3'terminationregpionfrompearibulose1,5-bisphosphatecatboxylFMV35S:玄参花叶病毒的358启动子(35Spomcderfromanodifedfigwortmosaicvinus)HSP70:矮牵牛热体克蛋白705'翻译前导序列(petuniaheitshorkpotein705'untranslatedleadeNOs:胭脂碱合酶基因终止子(terminatorofnopalinesynthasegene)。Pal2:来自菜豆苯丙氨酸解氨酶基因启动子(pmmoterforphenylalanineammoninlyasegpnefromPhaseolusyulganris)。Tag酶：源于水生栖热菌的耐热DNA聚合酶tRNALeu:叶绿体亮氨酸转运核糖核酸基因。UNG酶：尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)酶(uracil-N-gdycosylase)。应用TagMan探针技术，根据常用的筛选基因(启动子，终止子等)序列、品系特异性序列和苜蓿内源基因序列，设计引物和荧光探针，对样品中基因组DNA进行PCR扩增。在PCR反应过程中，荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，因此可根据荧光信号的强度判定样品中是否含有特定的基因。5防污染措施检测过程中防止交叉污染的措施应按照GB/T19495.2中的规定执行6取样和制样按照GB/T19495.7中规定的方法执行。将取样所得的苜蓿样品在粉碎机中研磨成粉末。7样品基因组DNA的提取按照GB/T19495.3中规定的方法执行实时荧光PCR仪：生物安全柜；消毒灭菌锅；核酸蛋白分析仪；高速冷冻离心机；台式小型离心机；Mim个人离心机，低温冰箱；冷藏冷冻冰箱；纯水器或双燕水器；旋涡振荡器；移液枪(量程0.5μL-10μL、量程10pL-100L、量程9主要试剂除另有规定外。所有试剂均为分析纯或生化试剂dTTP、dCTP、dGTP、dUTP;UNG酶；Tag酶；引物和探针；首蓿中转基因成分实时荧光PCR检测所用引物和探针序列见表1。上游引物(F)GATCAGTGAACTTCCCAAA内源基因(任选其下游引物(R)探针(P)VIC-TGAATGCTOCTGTGATCTGCOCATGC-B上游引物(F)下游引物(R)探针(P)FAM-GCAATOCDGACCCAAATOC-T上游引物(F)AAGACATCCACOGAAGACT下游引物(R)AGGACAGcTCrrrtCCA0G探针(P)FAM-TGGTCOBCACAAGOCAGCDCCTCGA-T上游引物(F)下游引物(R)探针(P)FAM-CATCCC,AAGACOGCCAACAG上游引物(F)下游引物(R)探针(P)FAM-ceG0GToCCGATGGCCTO00CA-T上游引物(F)GTGTGTACGCMTACAAAGTCLA探针(P)FAM-TATTCATGTCATGTGTTTrGTAC上游引物()探针(P)FAM6.icTCGAGCAGGACCTCCA-上游引物(F)下游引物(R)探针(P)FAM-TIOCCGGACATGAAGOCATTTACA-10.1明性对照、阳性对照和空白对照的设置阴性目标DNA对照：采用不含有待测基因序列的基因组DNA为模板。阳性对照：采用含有待测基因序列的植物DNA或含有待测基因序列的质粒DNA为模板。设两个空白对照：——提取DNA时设置的提取空白对照(以水代替样品);——PCR反应的空白对照(以水代替DNA模板)10.2反应体系PCR反应体系见表2。每个样品各做2个平行管。加样时应使样品DNA溶液完全加入反应液中，不要黏附于管壁上，加样后应尽快盖紧管盖。表2PCR反应体系(不含氯化镁)dYTP(含dUTP)上游引物(F)下游引物(R)探针(p)210.3PCR反应参数实时荧光PCR反应参数为：50℃2min;预变性95℃10min;95℃15s,60℃Imin,40个循环。10.4仪器检测通道的选择PCR反应管荧光信号收集的设置，应与探针所标记的报告基团一致，报告基团为FAM时，荧光信号收集应设在FAM通道；报告基团为VIC时，荧光信号收集应设在VIC通道。具体设置方式因仪器而异，可参照仪器使用说明书10.5实时荧光PCR反应运行按预先设定的样品摆放顺序将PCR反应管依次摆放(上机前应注意检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄漏污染仪器),开始运行仪器进行实时荧光PCR反应10.6结果分析10.6.1基线和阅值设置实时荧光PCR反应结束并分析结果时，应设置基线和阙值。基线范围设置在3个-5个循环。基线值设置在基线刚好超过正常阴性目标DNA对照扩增曲线最高点且a等于40。通常情况下可以采用仪器默认的基线阈值，即采用3个~15个循环的阴性目标DNA对照的10倍标准差作为阅值。10.6.2Ct值与DNA浓度的关系检测内源基因时C值应小于或等于36,如果C值大于36则说明DNA模板量很少，或DNA提取质量存在问题，或DNA提取液中有抑制PCR反应的因子存在，应适当增加模板量，或重新提取检测外源基因时C值大于或等于40,表明PCR过程中无目标DNA的扩增；Ca值在36-40之间，且平行样的每个值之间的差异很大，表明PCR反应体系中的目标DNA量很少，应适当增加模板量。11质量控制11.1基本原则：实验室中设置的各种对照检测结果应符合以下情况。否则，任一种对照如果出现非下述正常结果，应重做实验。11.2空白对照：外源基因检测C值大于或等于40,内源基因检测a值大于或等于40。11.3阴性对照：外源基因检测C值大于或等于40。11.4阳性对照：外源基因检测C值小于或等于36。12筛选检测和鉴定检测的选择对苜蓿中转基因成分的检测，可参考附录A的内容，先筛选检测FMV35S、NOS和CP4-EPSPS基因，筛选检测结果阴性则直接报告结果若筛选检测结果阳性，则需进一步鉴定检测J101、J63和KK179品系特异性基因，以确定是何种转基因苜蓿品系。13结果判断13.1待检样品外源基因检测c值大于或等于40,内源基因检测Cu值小于或等于36,设置的对照结果正常者，则可判定该样品未检出×xk基因。13.2待检样品外源基因检测a值小于或等于36,内源基因检测Cr值小于或等于36,设置的对照结果正常者，则可判定该样品检出××k×基因。13.3待检样品外源基因检测C值在36-40之间。应重做实时荧光PCR扩增。再次扩增后的结果Cr值仍小于40,且设置的对照结果正常，则可判定该样品检出xxx基因；再次扩增后结果Ct值大于等于40,且设置的对眼保正常，