细菌内毒素检查法讲义

细菌内毒素检查法

常胜凯药理室背景介绍：一、细菌内毒素二、热原三、鲎一、细菌内毒素细菌内毒素是一种革兰氏阴性细菌细胞壁的产物，当其死亡或菌体裂解时释放出的一类具有多种生物活性的毒性物质特性：（1）.致热性：内毒素作用人体细胞，使之释放内源性热原，刺激下丘脑体温调节中枢，引起发热反应。（2）.耐热性：需250度干热30分钟才能彻底灭活。（3）.分子极性：多糖链亲水，脂肪链疏水，在水中呈不均匀分布。（4）.鲎反应：能与鲎试剂发生多级酶促反应，形成凝胶。二、热原热原是指临床上引起哺乳动物发热反应的物质

细胞分裂素（IL-1,IL-2,IL-6,IL-8

）内源性热原产生细胞分裂素的物质

内毒素热原外源性热原非内毒素热原（病毒、细菌、真菌、抗体-抗原复合物、细胞分裂素）热原和内毒素的关系：热原是否就是内毒素？在学术上仍有争议，热原不仅是细菌内毒素。但在药检的范畴，细菌内毒素是主要的热原物质，可以说无内毒素就无热原，控制内毒素就是控制热原。三、鲎鲎(horseshoecrab)是一类与三叶虫(现在只有化石)一样古老的动物。鲎的祖先出现在地质历史时期古生代的泥盆纪，当时恐龙尚未崛起，原始鱼类刚刚问世，随着时间的推移，与它同时代的动物或者进化、或者灭绝，而惟独只有鲎从4亿多年前问世至今仍保留其原始而古老的相貌，所以鲎有“活化石”之称。又具有很高的药用价值。鲎鲎试剂鲎的血液中含有铜离子，它的血液是蓝色的。鲎血液颜色呈蓝色，是因为鲎血浆的主要成分是血蓝蛋白。这种蓝色血液的提取物——“鲎试剂”。鲎试剂是由海洋生物鲎的血液提取物制成的“鲎试剂”，能够准确、快速地检测人体是否因细菌感染而致病；鲎试剂在制药行业中，用于检测细菌内毒素。目前使用的鲎试剂分为美洲鲎试剂和东方鲎鲎试剂两大类。2010年版药典细菌内毒素

检查法介绍整体结构1.综述部分检查法的描述试验的准备限值（L）的确定确定最大有效稀释倍数（MVD）2.实验部分凝胶法 光度测定法a鲎试剂灵敏度复核 a标准曲线的可靠性实验b干扰实验 b干扰实验c检查法：限量试验 c检查法半定量试验 综述部分1.检查法的描述2.试验的准备3.限值（L）的确定4.确定最大有效稀释倍数（MVD）细菌内毒素检查法的定义：本法是利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝聚反应的机理，以判断供试品中的细菌内毒素限度是否符合规定的一种方法。细菌内毒素检查法介绍细菌内毒素检查包括：限量实验凝胶法半定量实验可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。

浊度法动态浊度法光度测定法终点浊度法显色基质法动态显色法终点显色法

试验的准备实验所需物品细菌内毒素标准物质细菌内毒素检查用水凝胶法鲎试剂漩涡混合器适宜的恒温器37±1℃电热干燥箱250℃实验器械等细菌内毒素标准物质a国家标准品

以内毒素国际标准品为基准标定效价。系自大肠埃系菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。150600-20070710000EU/支b工作标准品

以内毒素国家标准品为基准标定效价。用于试验中鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。150601-200968150EU/支150601-201072120EU/支细菌内毒素检查用水用于复溶内毒素标准品、稀释内毒素及样品、溶解鲎试剂等a凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水b光度测定法细菌内毒素检查用水，其内毒素含量应小于0.005EU/ml漩涡混合器漩涡混合器干热恒温器恒温水浴试验器械移液管（或刻度吸管、微量加样器及无热原吸头）、凝集管（10×75mm）、试管、试管架、洗耳球、封口膜、计时器、75%酒精棉、剪刀、砂轮。试验的准备

试验的准备

试验器械的要求试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。常用的方法是在250℃干烤至少30分钟，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。若使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。试验操作过程应防止微生物是污染。试验的准备供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。一般要求供试品溶液的pH值在6.0～8.0的范围内。对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，可使用酸、碱溶液或鲎试剂生产厂家推荐的适宜的缓冲液调节pH值。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。限值（L）的确定药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）除药典有规定的，一般按以下公式确定：

L＝K／MK为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/(kg·h)表示，注射剂K=5EU/(kg·h)，放射性药品注射剂K=2.5EU/(kg·h)，鞘内用注射剂K=0.2EU/(kg·h)；M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以ml/(kg·h)、mg/(kg·h)或U/(kg·h)表示，人均体重按60kg计算，人体表面积按1.62㎡计算。注射时间若不足1小时，按1小时计算。供试品每平方米体表面积剂量乘以0.027即可转换为每千克体重剂量（M）按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用药实际情况做必要调整，但需说明理由。限值计算时做必要调整的几种情况从严原则联合用药特殊情况等限值（L）的确定确定最大有效稀释倍数（MVD）

最大有效稀释倍数是指供试品溶液被允许稀释的最大倍数，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。MVD＝cL／λ

L：供试品的内毒素限值

c：供试品溶液的浓度

λ：在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度(EU/ml)，或在光度测定法中所使用的标准曲线上最低的内毒素浓度(如标准曲线为50、5、

0.5EU/ml三个浓度组成)计算举例a当L以EU/ml表示时，则浓度C的单位为1.0ml/ml

适用于供试品为溶液状态，并且规定限值为应小于xxEU/ml。

例：替硝唑注射液，计算限值为0.5EU/ml，使用灵敏度为0.125EU/ml的鲎试剂进行检验，则：MVD＝1.0ml/ml×0.5EU/ml÷0.125EU/ml＝4倍确定最大有效稀释倍数（MVD）

计算举例b当L以EU/mg表示时，则C的单位为mg/ml或U/ml适用于供试品为固体状态，如粉针；或液体但是规定限值为应小于xxEU/mg或EU/U。例：注射用阿莫西林钠计算限值为0.15EU/mg，使用灵敏度为0.25EU/ml的鲎试剂进行检验。需先称取一定重量的注射用阿莫西林钠，在已除去外源性内毒素的容器中，用细菌内毒素检查用水配制成一定浓度的溶液。如称取100mg注射用阿莫西林钠，用5ml内毒素检查用水溶解，即成为浓度为20mg/ml的阿莫西林钠溶液。MVD＝20mg/ml×0.15EU/mg÷0.25EU/ml＝12倍如果供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD

取1，计算供试品的最小有效稀释浓度c=λ/L

；适用于供试品为固体的情况。计算得到的最小有效稀释浓度即为MVD下的该供试品的浓度。

例：注射用阿莫西林钠计算限值为0.15EU/mg，使用灵敏度为0.125EU/ml的鲎试剂进行检验。最小有效稀释浓度c

＝0.125EU/ml÷0.15EU/mg＝0.833mg/ml实验部分

凝胶法光度测定法a鲎试剂灵敏度复核a标准曲线的可靠性实验b干扰实验b干扰实验c检查法：限量试验c检查法

半定量试验目的－考察鲎试剂的灵敏度是否准确－考察检验人员操作方法是否正确－实验条件是否符合规定何时进行－使用新批号的鲎试剂－试验条件发生可能影响检验结果的改变时

鲎试剂灵敏度复核试验实验操作:取细菌内毒素国家标准品或工作标准品一支，加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合15分钟。然后进行稀释，制备成4个浓度的细菌内毒素标准溶液,即2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ（λ为所复核的鲎试剂的标示灵敏度），每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟。鲎试剂灵敏度复核试验

内毒素浓度2λλ0.5λ0.25λ阴性对照鲎试剂平行管○○○○○○○○○○○○○○○○○○鲎试剂灵敏度复核试验放入37℃±1℃的恒温器中，保温60分钟±2分钟将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；形成的凝胶不坚实、变形或从管壁滑脱者为阴性；保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。坚实凝胶阳性“+”未形成凝胶凝胶不坚实阴性“—”结果判断：若最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管阴性，试验方有效。结果计算：反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值λc=lg-1(ΣX/4)

式中X为反应终点浓度的对数值（lg）。（反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。）鲎试剂灵敏度复核试验鲎试剂灵敏度复核试验内毒素浓度2λλ0.5λ0.25λ阴性对照终点鲎试剂平行管●●○○○λ●●○○○λ●●●○0.5λ●●●○0.5λλc=lg-1[(lgλ+lgλ+lg0.5λ+lg0.5λ)/4]=0.707λ当λc在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）时，方可用于细菌内毒素检查。实验时，以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。鲎试剂灵敏度复核试验凝胶法干扰试验目的：是确定供试品在多大的稀释倍数或浓度下对内毒素和鲎试剂的反应不存在干扰作用，为能否使用细菌内毒素检查法提供依据。凝胶法干扰试验当进行新药的内毒素检查试验前，或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时，须进行干扰试验。（注：须三个批号以上的供试品，两个以上鲎试剂厂家的试剂）当鲎试剂、供试品的处方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。如：内毒素检查时，供试品阳性对照为阴性时。凝胶法干扰试验预试验正式干扰试验目的：初步确定供试品的最大不干扰浓度（当限值以EU/mg或EU/U活性单位表示）或最小不干扰稀释倍数（当限值以EU/ml表示），为正式干扰实验提供依据；优点：减少摸索过程、节省成本。预试验操作步骤：将供试品溶液进行一系列倍数的稀释；使用鲎试剂对每一稀释倍数进行检验，每一稀释倍数下做2支供试品管和4支供试品阳性对照（即含2.0λ和0.25λ浓度标准内毒素的该浓度的供试品稀释液）；另做2支阴性对照和2支阳性对照。预试验预试验结果判断：当阴性对照为阴性，阳性对照为阳性时，实验为有效；当系列浓度中出现供试品溶液2管为阴性，供试品阳性对照2管为阳性时，供试品阳性对照0.25λ管均为阴性时，认为供试品在该浓度下不干扰实验，此稀释倍数即为最小不干扰稀释倍数。即可选择该稀释倍数和相邻浓度进行正式干扰实验。预试验正式干扰试验

目的：检验在某一浓度下的供试品对于鲎试剂与内毒素的反应有无干扰作用。通过比较鲎试剂与在水溶液中的内毒素和供试品溶液中的内毒素反应的差异程度，来确定供试品在该浓度下是否对内毒素检查有干扰。正式干扰试验操作：用内毒素检查用水和供试品将同一支内毒素标准品分别制备一系列浓度的内毒素溶液操作：内毒素检查用水同一支内毒素标准品供试品溶液同时制备2支供试品阴性对照和2支阴性对照。

含2.0λ、λ、0.5λ、0.25λ的内毒素标准溶液含2.0λ、λ、0.5λ、0.25λ的内毒素的供试品溶液

编号内毒素浓度/配制内毒素的溶剂稀释用液稀释倍数所含内毒素的浓度平行管数A无/供试品溶液－－－2B2λ/供试品溶液供试品溶液12λ421λ440.5λ480.25λ4C2λ/检查用水检查用水12λ421λ440.5λ480.25λ4D无/检查用水－－－2A：供试品溶液B：供试品阳性对照C：阳性对照D：阴性对照结果判断当供试品阴性对照A和阴性对照D都为阴性，并且系列溶液C的结果在鲎试剂灵敏度范围内时，试验方为有效。分别计算用检查用水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值（ES）和用供试品溶液和稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的几何平均值（Et）；

ES=lg-1(ΣXS/4)Et=lg-1(ΣXt/4)当ES在0.5λ～2λ(包括0.5λ和2λ)及Et在0.5ES～

2ES（包括0.5ES和2ES）时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。内毒素浓度2.0λλ0.5λ0.25λ终点内毒素/检查用水（系列溶液C）●●○○λ●●○○λ●●○○λ●●○○λ阴性对照（溶液D）○○内毒素/供试品溶液（系列溶液B）●●○○λ●●○○λ●○○○2.0λ●○○○2.0λ供试品阴性对照（溶液A）○○

ES=lg-1(ΣXS/4)＝λEt=lg-1(ΣXt/4)＝1.41λ当存在干扰时，可通过对供试品进行更大倍数的稀释或有关其他适宜的方法（如过滤、中和、透析或加热处理等）排除干扰。导致干扰的因素：排除干扰的方法：pH值稀释抗凝因子中和螯合剂过滤葡聚糖加热凝胶法干扰试验由于干扰实验检验的是在供试品存在的情况下内毒素与鲎试剂的反应是否正常，与所使用鲎试剂的灵敏度无关，因此在干扰实验中原则上可使用任一灵敏度的鲎试剂。建议使用较低灵敏度（如0.5或0.25EU/ml）的鲎试剂，可尽量避免供试品所含的内毒素对干扰实验造成的阳性影响。检查法－凝胶法凝胶限度试验凝胶半定量试验凝胶限度试验检验供试品中的内毒素含量是否小于限度的定性方法。编号内毒素浓度/配制内毒素的溶液平行管数A供试品溶液无/供试品溶液2B供试品阳性对照2λ/供试品溶液2C阳性对照2λ/检查用水2D阴性对照无/检查用水2当阴性对照溶液D的平行管均为阴性，供试品阳性对照溶液B的平行管均为阳性，阳性对照溶液C的平行管均为阳性，试验有效例：替硝唑注射液，计算限值为0.5EU/ml，使用灵敏度为0.25EU/ml的鲎试剂进行检验，计算：

MVD＝1.0ml/ml×0.5EU/ml÷0.25EU/ml＝2倍供试品溶液：2倍替硝唑稀释液供试品阳性对照为：含0.25EU/ml标准内毒素的2倍替硝唑稀释液阳性对照为：浓度为0.25EU/ml的标准内毒素溶液凝胶限度试验结果判断供试品溶液供试品阳性对照阴性对照阳性对照○○●●○○●●试验有效凝胶限量试验结果判断供试品溶液供试品阳性对照阴性对照阳性对照○○●●○○●●此批替硝唑注射液的内毒素含量小于0.5EU/ml，符合规定供试品溶液供试品阳性对照阴性对照阳性对照●●●●○○●●此批替硝唑注射液的内毒素含量不小于0.5EU/ml，不符合规定凝胶限量试验结果判断供试品溶液供试品阳性对照阴性对照阳性对照○●●●○○●●须复试复试时，供试品溶液需做4支平行管，若所有平行管均为阴性，判供试品符合规定；四管中如有一管为阳性，即可判供试品不符合规定。供试品溶液供试品阳性对照阴性对照阳性对照○○○○●●○○●●凝胶半定量试验半定量试验是使用凝胶法估测供试品中内毒素含量的方法，系通过反应终点浓度来量化供试品中内毒素的含量。原理：通过供试品系列稀释液与鲎试剂反应，其反应终点浓度的稀释倍数与鲎试剂灵敏度的乘积即为供试品的内毒素含量。凝胶半定量试验操作：用检查用水将供试品溶液从已确定的不干扰浓度和稀释倍数下开始进行对倍稀释，制备成2、4、8倍的稀释液，但最大稀释倍数不得超过所使用鲎试剂的MVD。凝胶半定量试验溶液的制备编号内毒素浓度/配制内毒素的溶剂稀释用液稀释倍数所含内毒素的浓度平行管数A无/供试品溶液检查用水1－22－24－28－2B2λ/供试品溶液2λ2C2λ/检查用水检查用水12λ221λ240.5λ280.25λ2D无/检查用水－－－2A：没有超过MVD并且通过干扰试验的供试品系列稀释液；B：供试品阳性对照（为确证不存在干扰作用）；C：标准内毒素系列（为确证本试验的操作和环境都符合规定）；D：阴性对照。凝胶半定量试验－结果判断当阴性对照溶液D的平行管均为阴性；供试品阳性对照溶液B的平行管均为阳性；系列溶液C的反应终点浓度的几何平均值在0.5λ～2λ之间，则试验有效。若内毒素浓度小于规定的限度，判供试品符合规定。若内毒素浓度大于或等于规定的限度，判供试品不符合规定。凝胶半定量试验－结果计算内毒素浓度2.0λλ0.5λ0.25λ终点标准内毒素系列溶液C●●●○0.5λ●●○○λ稀释倍数1248供试品系列溶液A●●●○4×λ●●○○2×λ供试品阳性对照溶液B●●阴性对照溶液D○○CE＝lg-1(ΣX/2)=lg-1[(lg4λ+lg2λ)/2]=2.83λ例：右旋糖酐20葡萄糖注射液，限值为0.5EU/ml；通过使用3个鲎试剂厂家的鲎试剂对3个不同厂家的7个样品进行干扰试验证实：右旋糖酐20葡萄糖注射液稀释2倍后即不干扰内毒素检查；使用灵敏度为0.03EU/ml的鲎试剂对一批右旋糖酐20葡萄糖注射液进行凝胶半定量试验。MVD＝0.5EU/ml÷0.03EU/ml＝16.67倍从已确定不干扰的稀释倍数2倍起，再进行1、2、4、8倍稀释(相当于将供试品原液进行了2、4、8、16倍稀释，最终的稀释倍数没有超MVD)。内毒素浓度0.060.030.0150.0075终点标准内毒素系列溶液C●●●○0.015●●○○0.03稀释倍数1248供试品系列溶液A●●●○4×0.03●●○○2×0.03供试品阳性对照溶液B●●阴性对照溶液D○○CE＝lg-1(ΣX/2)=lg-1[(lg4λ+lg2λ)/2]=2.83λ＝0.0849E