马鼻肺炎诊断技术-编制说明

一、工作简况

（一）任务来源

马鼻肺炎是由马疱疹病毒（Equineherpesvirus,EHV）1型和4型引起马属

动物的一种急性热性传染病，临床表现为发热、白细胞减少、呼吸道症状、流产、

脑脊髓炎等神经症状。EHV-1主要引起妊娠母马病毒性流产，还可引起轻微的呼

吸道症状、马驹死亡、脑脊髓炎等神经症状，近年来由EHV-1引起的神经症状

在世界各地的发生均有上升趋势。2021年3月，欧洲爆发了数十年来最严重的

马疱疹病毒1型疫情，欧洲十国取消了国际马术联盟（FEI）赛事。2022年3月，

美国加利福利亚州也爆发严重的马疱疹病毒1型疫情。EHV-4主要引起马传染

性鼻肺炎，主要发生在于2岁以下幼驹，成年马多呈良性经过，偶尔可引起流产。

EHV-1和EHV-4均可通过呼吸道感染，但EHV-4感染仅局限于呼吸道，而EHV-

1可继续感染淋巴细胞，引起病毒血症，并且可扩散到母畜子宫或者神经系统从

而引起流产或神经性疾病。与EHV-4相比，EHV-1对养马业造成的损失更为严

重。

传统的诊断采用细胞培养分离病原后再进行血清型鉴定。常用的血清学方法

主要有病毒中和试验、酶联免疫吸附法（ELISA）以及补体结合试验等。血清学

方法优点在于可以在较短时间内得出诊断结果，但该方法也存在一定的局限性，

即只能针对机体与病毒作用产生的抗体进行检测，这样一来，检测结果就会受到

免疫接种等许多因素的干扰。目前，聚合酶链式反应（PCR）检测技术的应用日

渐增多，实时荧光定量PCR，与常规PCR相比，具有特异性更强、有效解决PCR

污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。

因此，根据全国动物防疫工作的需要，国家标准化管理委员会《关于下达

2022年第二批推荐性国家标准计划及相关标准外文版计划的通知》（国标委发

[2022]22号）将《马鼻肺炎诊断技术》（20220547-T-326）列入2022年动物卫生

国家标准立项项目清单，上海海关动植物与食品检验检疫技术中心、新疆农业大

学和青岛海关技术中心，多年来从事马鼻肺炎的诊断、检测和疫病防控研究工作，

于2021年向国家标准化管理委员会申报了修订国标《马鼻肺炎诊断技术》标准

项目，并于2022年获得了批准（20220547-T-326）。

（二）起草单位

本标准由上海海关动植物与食品检验检疫技术中心、新疆农业大学、青岛海

关检验检疫技术中心和江苏农牧科技职业学院共同起草。

王艳：标准修订项目负责人，全面负责标准的立项、实施，主持该项目的总

体方案设计研究和标准的编制。根据分工，定期组织会议调整工作进度和工作方

式。全面负责标准的审阅、修订工作，策划和组织专家及试用单位对标准进行审

阅和复核验证。

刘建华、朱来华、胡月、郑晓龙、武彩红、王群：项目技术部分执笔起草人。

协助该标准修订项目的总体方案设计研究以及组织实施。协助标准及相关报告、

附件等的审阅和修订，负责相关技术文件的整理。负责诊断技术确立和标准化、

技术信息收集工作、资源调查工作。起草编制说明等相关文件，是技术标准化试

验的主要操作者。

冯之航、林颖峥、蔡一村、薛俊欣、张强：协助该标准制定项目的总体方案

设计研究以及组织实施。协助相关技术文件的整理。负责部分相关技术文件的整

理及标准验证。

（三）主要工作过程

2011年12月30日发布，2012年4月1日年施行的国家标准《马鼻肺炎病

毒PCR检测方法》只规定了马鼻肺炎病毒的PCR检测方法，由于在实际工作中

该方法应用偏少，且显著滞后于目前实际情况，上海海关动植物与食品检验检疫

技术中心、新疆农业大学、青岛海关检验检疫技术中心和江苏农牧科技职业学院

经过协商，起草修订此标准。修订过程主要分为资料收集分析阶段、技术确立和

标准化阶段、标准征求意见稿研制阶段和标准送审稿研制阶段。各阶段主要工作

过程分述如下：

技术路线：主要包括资料收集分析及技术确立与标准化阶段、标准征求意见

稿阶段、标准送审稿阶段到最终形成标准报批稿。

1、计划阶段

2022年初，是项目计划阶段。上海海关动植物与食品检验检疫技术中心、新

疆农业大学、青岛海关检验检疫技术中心和江苏农牧科技职业学院组织相关主要

完成人员，成立了修订《马鼻肺炎诊断技术》国家标准的项目组。2022年1月至

2022年3月资料收集分析及技术确立与标准化阶段：成立项目组，通过文献、

标准技术检索，OIE《陆生动物诊断试验和疫苗手册》，总结国家标准（GB/T27621-

2011）存在的问题与不足，并对标准中的核心技术进行标准化及验证工作。

2、实施和完成阶段

2022年4月至2023年6月，是项目实施和完成阶段。

（1）标准“征求意见稿”阶段：2022年4月-2022年12月，完成该项标准

“征求意见稿”的编制。

（2）标准“送审稿”阶段：2023年1月-2022年5月，完成标准所列主要

技术的复核试验后，按要求送有关专家征求意见，对专家的意见进行汇总、整理，

参照反馈的意见对征求意见稿进行细致入微的修订形成标准“送审稿”报审。

（3）标准“报批稿”阶段：2023年6月，根据审查意见对送审稿进行修改，

完成标准“报批稿”。

二、标准编制原则和确定标准主要内容的依据

（一）标准编制原则

国家标准《马鼻肺炎诊断技术》是根据我国当前马疱疹病毒1型和4型引起

的马鼻肺炎的防制技术需要，在原有国家标准（GB/T27621-2011）《马鼻肺炎病

毒PCR检测方法》基础上修订的。旨在对该病的确诊提供规范性技术及文件。

标准的编写是按照GB/T1.1-2020进行的。

（二）提出本标准的依据

《马鼻肺炎诊断技术》（GB/T27621-2011）是2011年12月发布的。该标准

所涉及的技术仅涉及普通PCR的检测方法，已不能满足当前及今后一段时期我

国马鼻肺炎诊断的技术需求。其主要缺陷为：（1）该诊断标准没有病原分离，而

病原分离是该病诊断的传统诊断方法之一；（2）该诊断标准中没有实时荧光PCR

方法，而利用实时荧光PCR对EHV-1和EHV-4型的检测，进行EHV-1和EHV-

4诊断，已得到国内外很多实验室的认可；（3）该诊断标准缺少血清学方法，血

清学方法是诊断该病的重要的辅助技术，因此血清学检测是诊断。此外，该诊断

标准没有说明所列的检测技术对该病的初步诊断和确诊有何意义，也没有给出该

病初步诊断和确诊的判定依据。

本次对马鼻肺炎诊断技术的修订，目的有两个：一是与国际标准基本保持一

致，改变国家标准显著滞后于国际标准的状况；二是将一些在国内外经过多年实

践证明成熟可行的新技术纳入进来，改变原有标准中检测技术偏少、且显著滞后

于实际应用的状况。

修订后的标准分前言、范围、规范性引用文件、缩略语、临床症状、病毒分

离鉴定、微量血清中和试验、酶联免疫吸附试验、荧光PCR检测方法、PCR检测

方法、综合判断和附录等共12个部分。此标准修订后，有利于我国马鼻肺炎诊

断和监测，也有利于提升国家标准的权威性、实用性。

（三）制定本标准的基础

上海海关动植物与食品检验检疫技术中心、新疆农业大学、青岛海关检验检

疫技术中心和江苏农牧科技职业学院，一直致力于马鼻肺炎的流行病学调查、诊

断和快速检测技术研究，为本标准的制定奠定了良好的基础。

（四）实验内容

1、EHV1和EHV4荧光PCR检测方法；

2、EHV1和EHV4荧光PCR检测方法的特异性；

3、EHV1和EHV4荧光PCR检测方法的敏感性；

4、病毒分离的验证；

5、微量血清中和试验的验证。

（五）实际应用效果

本标准在本实验室和3家外部实验室分别进行了验证和实际应用，证实该标

准中的荧光方法特异、敏感、可满足不同类型样品的实际检测需求，效果良好。

三、主要试验或验证的分析、综述报告，技术经济论证，预期的经

济效果

（一）主要试验或验证的分析

3.1荧光PCR

3.1.1引物序列

EHV1F:GGGGTTCTTAATTGCATTCAGACC;

EHV1R:GTAGGTGCGGTTAGATCTCACAAG;

EHV1P:FAM-TCTCCAACGAACTCGCCAGGCTGTACCBHQ1;

EHV4F:TAGCAAACACCCACTAATAATAGCAAG

EHV4R:GCTCAAATCTCTTTATTTTATGTCATATGC

EHV4P:JOE-CGGAACAGGAACTCACTTCAGAGCCAGC-BHQ1

3.1.2荧光PCR方法的建立

获得最佳反应体系和反应参数后，通过对荧光PCR各条件进行优化，获得了

最佳的反应体系和循环参数：95℃5min；95℃15s，60℃30s，40个循环。退

火延伸时检测荧光信号。

表1荧光定量RT-PCR反应成份（20μL体系）

成份ddH2OBuffer上游引物下游引物探针模板

单位浓度2χ10μmol/L10μmol/L10μmol/L

加样量(μL)6100.80.80.42

建立了检测EHV-1和EHV-4的扩增曲线（图1）

图1EHV-1和EHV-4扩增曲线

3.1.3荧光定量PCR的敏感性

经过检测，EHV-1和EHV4荧光定量PCR的最低检出限为分别为3拷贝数/uL

和30拷贝数/uL。

A

B

图2EHV-1和EHV-4敏感性检测结果

AEHV-1BEHV-4

3.1.4荧光定量PCR的特异性

对5份其他相关病原（EIV、EAV、EIA、AHV-1、BHV-1）进行检测，仅EHV-

1和EHV-4出现特异性扩增，其他病原未出现扩增，表明该方法具有良好的特异

性。

图4EHV-1和EHV-4特异性检测

3.3病毒分离

3.3.1样品采集

鼻咽拭子的处理：鼻咽拭子和3mL运输培养基放入灭菌的10mL注射器，

转动注射器活塞，将拭子中的液体挤到一灭菌试管中。挤出的液体一部分通过灭

菌的0.45μm薄膜滤菌器滤入第2支无菌试管，保存备用。

动物组织样品的处理：将肝、肺等组织混合，在无菌玻璃平皿中用解剖剪将

组织块剪碎成约1mm3的小块，加入含抗生素（附录A.1）的无血清培养基，于

组织研磨器中研磨，1000r/min离心10min，吸出上清，备用。

抗凝全血的处理：试管上下颠倒充分混合后，室温静置1小时以上，用PBS

按照1:1的比例稀释，上下点掉混匀或用移液枪吹打混匀；在15mL离心管中，

先加入3mL充分混匀的Ficoll液（1.077密度），再沿着管壁小心加入2mL上

述稀释后的血液，血液和Ficoll液分层明显为成功；1500r/min离心25min后，

弃上清，吸取中间层的白色薄膜层，用10mLPBS洗涤获得的单个核细胞，1500

r/min离心10min，弃上清，重复洗涤一次并重悬细胞备用。

3.3.2病毒分离

将处理好的样品上清液或细胞悬液接种到已长成单层的RK-13细胞（EHV-1

型）或E-derm细胞（EHV-4型）37℃培养1h使病毒吸附。另设未接种的单层

细胞作为对照组，仅加培养基同时孵育。

病毒吸附后，除去接种物，用PBS冲洗两次，添加维持液，置37℃培养，观

察细胞出现病变的情况。

正常细胞图细胞病变图

抗凝血的病毒适用于EHV-1的鉴定。

3.3.3微量血清中和试验

3.3.3.1中和病毒滴度（TCID50）测定

3.3.3.1.1中和病毒制备

将保存于液氮中的标准种毒取出置于4℃缓慢融化，参考其他标准，将融

化的种毒用维持液作60倍稀释后，取1mL接种于长满单层RK-13细胞的细胞瓶

中，吸附1h。然后，先用维持液洗涤一次，再加入维持液，放置于37℃恒温培

养箱中培养3648h，当50%75%细胞出现CPE，即可收获病毒培养液，分装

成1mL后冻存（-70℃以下）备用。

3.3.3.1.2病毒滴度测定

在微量细胞培养板（96孔）每孔加25uL细胞培养液，用病毒稀释液将冻

存病毒做10-1,10-2……10-8系列稀释，每一稀释度的病毒接种八孔，每孔25uL。

正常细胞对照，四孔至八孔不加病毒，仅加25uL病毒稀释液。每孔100UlRK-

13细胞或E-derm（5104/100uL）。置37℃培养，3d后初判，4-5d终判。如

细胞对照正常，接种病毒的细胞出现CPE（细胞圆缩、脱离、裂解），记录试验

数据。根据Karber法计算该批病毒的毒价（半数组织感染量TCID50）。

3.3.3.1.3中和试验

1）在96孔细胞培养板上每孔加25μL无血清的MEM。取每一被检血清25μL,加

于A排和B排两重复孔内。第1排作为血清毒性对照，第2排是被检血清的第1次稀

释。从B排开始向下做倍比稀释，即混合后取25μL,加入下一孔，充分混合，同

法依次稀释，直至最后一孔。每板可测定6个血清样。

2）每孔加25μL适当稀释的EHV-1或EHV-4病毒（100TCID50/孔），A排除外。血

清的最终稀释度在加入病毒后为1/4到1/256。

3）另取一对照板，应包括滴定已知滴度的阴性和阳性马血清对照、细胞对照、

病毒对照和用于计算实验中病毒精确用量的病毒滴定验证。

4）细胞培养板放置于5%CO237℃培养箱中孵育1h。

5）每孔加50uL备好的E-Derm或RK-13细胞悬液，5%CO237℃培养箱中孵育4～5

d。

6）显微镜下观察CPE，记录试验结果。

3.3.3.2试验结果

阴性血清阳性血清对照细胞

2.8验证和技术复核

为验证及推广应用《马鼻肺炎诊断技术》标准，我们呼和浩特海关技术中心、

乌鲁木齐海关技术中心、广州海关技术中心3家实验室，对检测方法的特异性和

检测适用性进行了验证和技术复核。

验证结果表明，该标准中的荧光定量PCR方法可特异性检出EHV-1和EHV-

4，且与其他常见动物病毒无交叉反应，证实该标准中的荧光定量PCR方法可满

足诊断和检测需求，效果良好。试验复核结果说明此荧光定量PCR方法可靠。

（二）预期的经济效果

本标准的方法可用于国内动物疫病防控部门和养殖企业进马鼻肺炎的疫情

监测和快速诊断，节省检测时间，降低检测成本，有利于尽早采取防控措施，降

低经济损失，经济效益特别是社会效益显著。同时也为马鼻肺炎研究提供标准化

的检测规程。

四、采用国际标准和国外先进标准的程度

本标准的荧光PCR、病毒分离和中和试验规程基本参照OIE《陆生动物诊断

试验和疫苗手册》相关规程制定。

五、与有关的现行法律、法规和强制性国家标准的关系

本标准的修订与我国现行法律、法规及强制性国家标准无矛盾和冲突。

六、重大分歧意见的处理经过和依据

在专家征求意见稿送出以后，得到了各位专家的肯定，征集的修改建议均未

对本标准提出原则性的重大修改意见。针对审阅专家提出的建议，起草小组专门

进行了研讨，按照专家建议，对征求意见稿作了必要的修改、补充和删节。对各

位专家提出的其它有关标准结构的编排和文字表述的建议中，我们根据GB/T1.1-

2009的要求，对合理的建议均予以采纳。

七、标准性质（强制性，推荐性）的建议，特别是对建议批为强制性标准

的理由应充分说明

建议本标准为推荐性标准。

八、贯彻国家标准的要求和措施建议（包括组织措施、技术措施、

过渡办法等内容）

1、组织实施

标准发布后，可通过相关部门组织宣贯，推荐给有相应检测设施和检测项目

的国内各级实验室使用。

2、技术措施

可以委托项目起草单位或其他相关单位组织技术培训的方式推广应用本检

测标准。也可通过委托有资质的单位组织相关检测的能力验证活动，通过能力验

证也就表明参试单位有能力开展相应检测项目。

3、过渡办法

由于荧光PCR技术在国内已经比较成熟，应用单位只需要一定的培训即可

掌握。因此可以预期，本标准一旦发布实施，很快即可实现平稳过渡。建议本标

准自发布之日起实施。

九、废止现行有关标准的建议

无。

十、其他应予说明的事项。

无。

一、工作简况

（一）任务来源

马鼻肺炎是由马疱疹病毒（Equineherpesvirus,EHV）1型和4型引起马属

动物的一种急性热性传染病，临床表现为发热、白细胞减少、呼吸道症状、流产、

脑脊髓炎等神经症状。EHV-1主要引起妊娠母马病毒性流产，还可引起轻微的呼

吸道症状、马驹死亡、脑脊髓炎等神经症状，近年来由EHV-1引起的神经症状

在世界各地的发生均有上升趋势。2021年3月，欧洲爆发了数十年来最严重的

马疱疹病毒1型疫情，欧洲十国取消了国际马术联盟（FEI）赛事。2022年3月，

美国加利福利亚州也爆发严重的马疱疹病毒1型疫情。EHV-4主要引起马传染

性鼻肺炎，主要发生在于2岁以下幼驹，成年马多呈良性经过，偶尔可引起流产。

EHV-1和EHV-4均可通过呼吸道感染，但EHV-4感染仅局限于呼吸道，而EHV-

1可继续感染淋巴细胞，引起病毒血症，并且可扩散到母畜子宫或者神经系统从

而引起流产或神经性疾病。与EHV-4相比，EHV-1对养马业造成的损失更为严

重。

传统的诊断采用细胞培养分离病原后再进行血清型鉴定。常用的血清学方法

主要有病毒中和试验、酶联免疫吸附法（ELISA）以及补体结合试验等。血清学

方法优点在于可以在较短时间内得出诊断结果，但该方法也存在一定的局限性，

即只能针对机体与病毒作用产生的抗体进行检测，这样一来，检测结果就会受到

免疫接种等许多因素的干扰。目前，聚合酶链式反应（PCR）检测技术的应用日

渐增多，实时荧光定量PCR，与常规PCR相比，具有特异性更强、有效解决PCR

污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。

因此，根据全国动物防疫工作的需要，国家标准化管理委员会《关于下达

2022年第二批推荐性国家标准计划及相关标准外文版计划的通知》（国标委发

[2022]22号）将《马鼻肺炎诊断技术》（20220547-T-326）列入2022年动物卫生

国家标准立项项目清单，上海海关动植物与食品检验检疫技术中心、新疆农业大

学和青岛海关技术中心，多年来从事马鼻肺炎的诊断、检测和疫病防控研究工作，

于2021年向国家标准化管理委员会申报了修订国标《马鼻肺炎诊断技术》标准

项目，并于2022年获得了批准（20220547-T-326）。

（二）起草单位

本标准由上海海关动植物与食品检验检疫技术中心、新疆农业大学、青岛海

关检验检疫技术中心和江苏农牧科技职业学院共同起草。

王艳：标准修订项目负责人，全面负责标准的立项、实施，主持该项目的总

体方案设计研究和标准的编制。根据分工，定期组织会议调整工作进度和工作方

式。全面负责标准的审阅、修订工作，策划和组织专家及试用单位对标准进行审

阅和复核验证。

刘建华、朱来华、胡月、郑晓龙、武彩红、王群：项目技术部分执笔起草人。

协助该标准修订项目的总体方案设计研究以及组织实施。协助标准及相关报告、

附件等的审阅和修订，负责相关技术文件的整理。负责诊断技术确立和标准化、

技术信息收集工作、资源调查工作。起草编制说明等相关文件，是技术标准化试

验的主要操作者。

冯之航、林颖峥、蔡一村、薛俊欣、张强：协助该标准制定项目的总体方案

设计研究以及组织实施。协助相关技术文件的整理。负责部分相关技术文件的整

理及标准验证。

（三）主要工作过程

2011年12月30日发布，2012年4月1日年施行的国家标准《马鼻肺炎病

毒PCR检测方法》只规定了马鼻肺炎病毒的PCR检测方法，由于在实际工作中

该方法应用偏少，且显著滞后于目前实际情况，上海海关动植物与食品检验检疫

技术中心、新疆农业大学、青岛海关检验检疫技术中心和江苏农牧科技职业学院

经过协商，起草修订此标准。修订过程主要分为资料收集分析阶段、技术确立和

标准化阶段、标准征求意见稿研制阶段和标准送审稿研制阶段。各阶段主要工作

过程分述如下：

技术路线：主要包括资料收集分析及技术确立与标准化阶段、标准征求意见

稿阶段、标准送审稿阶段到最终形成标准报批稿。

1、计划阶段

2022年初，是项目计划阶段。上海海关动植物与食品检验检疫技术中心、新

疆农业大学、青岛海关检验检疫技术中心和江苏农牧科技职业学院组织相关主要

完成人员，成立了修订《马鼻肺炎诊断技术》国家标准的项目组。2022年1月至

2022年3月资料收集分析及技术确立与标准化阶段：成立项目组，通过文献、

标准技术检索，OIE《陆生动物诊断试验和疫苗手册》，总结国家标准（GB/T27621-

2011）存在的问题与不足，并对标准中的核心技术进行标准化及验证工作。

2、实施和完成阶段

2022年4月至2023年6月，是项目实施和完成阶段。

（1）标准“征求意见稿”阶段：2022年4月-2022年12月，完成该项标准

“征求意见稿”的编制。

（2）标准“送审稿”阶段：2023年1月-2022年5月，完成标准所列主要

技术的复核试验后，按要求送有关专家征求意见，对专家的意见进行汇总、整理，

参照反馈的意见对征求意见稿进行细致入微的修订形成标准“送审稿”报审。

（3）标准“报批稿”阶段：2023年6月，根据审查意见对送审稿进行修改，

完成标准“报批稿”。

二、标准编制原则和确定标准主要内容的依据

（一）标准编制原则

国家标准《马鼻肺炎诊断技术》是根据我国当前马疱疹病毒1型和4型引起

的马鼻肺炎的防制技术需要，在原有国家标准（GB/T27621-2011）《马鼻肺炎病

毒PCR检测方法》基础上修订的。旨在对该病的确诊提供规范性技术及文件。

标准的编写是按照GB/T1.1-2020进行的。

（二）提出本标准的依据

《马鼻肺炎诊断技术》（GB/T27621-2011）是2011年12月发布的。该标准

所涉及的技术仅涉及普通PCR的检测方法，已不能满足当前及今后一段时期我

国马鼻肺炎诊断的技术需求。其主要缺陷为：（1）该诊断标准没有病原分离，而

病原分离是该病诊断的传统诊断方法之一；（2）该诊断标准中没有实时荧光PCR

方法，而利用实时荧光PCR对EHV-1和EHV-4型的检测，进行EHV-1和EHV-

4诊断，已得到国内外很多实验室的认可；（3）该诊断标准缺少血清学方法，血

清学方法是诊断该病的重要的辅助技术，因此血清学检测是诊断。此外，该诊断

标准没有说明所列的检测技术对该病的初步诊断和确诊有何意义，也没有给出该

病初步诊断和确诊的判定依据。

本次对马鼻肺炎诊断技术的修订，目的有两个：一是与国际标准基本保持一

致，改变国家标准显著滞后于国际标准的状况；二是将一些在国内外经过多年实

践证明成熟可行的新技术纳入进来，改变原有标准中检测技术偏少、且显著滞后

于实际应用的状况。

修订后的标准分前言、范围、规范性引用文件、缩略语、临床症状、病毒分

离鉴定、微量血清中和试验、酶联免疫吸附试验、荧光