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文档简介
《空气中病原微生物宏基因组测序鉴定方法》
国家标准编制说明
(征求意见稿)
一、工作简况
(一)任务来源
本国家标准根据国标委发〔2021〕23号文件《国家标准化管理委员会关于下达2021
年第二批推荐性国家标准计划及相关标准外文版计划的通知》,正式确认立项,项目计划
编号为20213397-T-469,名称为《空气中病原微生物宏基因组测序鉴定方法》。本项任务由
中国计量科学研究院提出,由全国生化检测标准化技术委员会归口。
(二)协作单位
(三)目的和意义
悬浮于大气中的含有细菌、真菌、病毒或生物大分子的生物气溶胶粒子,与人类的生
命健康密切相关。空气中含有大多数呼吸道病毒(如流感病毒、腺病毒等)在内的约五百
多种致病性微生物,其中可经气溶胶传播的至少有100多种,占全部传播途径的首位,对
人类健康、社会经济发展造成了严重的威胁。被病原微生物污染的空气,常可成为污染的
来源或媒介,引起传染病流行。因此,进行空气中病原微生物的检测,建立空气病原微生
物的鉴定方法,对于日常环境、公共场所及医疗卫生环境的空气监测具有适用性,对于传
染病预防与控制以及环境的卫生学监督与保护具有重要的意义。
临床上传统的病原鉴定主要以培养和生化检测为基础,随着大规模并行高通量测序技
术的不断进步,宏基因组测序(metagenomicsnext-generationsequencing,mNGS)极大的
提高了病原检测的效率,并有助于识别难以培养的病原微生物。研究表明,当病原为病毒、
厌氧菌和真菌时,宏基因组测序诊断传染病的敏感性和特异性都显著优于传统培养方法。
重要的是,宏基因组测序可以确定传统方法无法确定的病原,该技术规避了绝大部分微生
物不能培养、痕量菌无法检测的缺点。由于微生物的多样性、种类复杂性以及较快的变异
性,通过高通量、快速、准确的宏基因测序方法进行鉴定,可以实现病原微生物的鉴定分
类与溯源。
目前DNA测序和宏基因组学方法虽已被用于土壤和水体环境微生物研究,但将其应
用于空气微生物的检测尚未标准化,存在样品DNA含量少、传统方法难以获得足够DNA
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进行测序等技术困难。国外也尚未制定相关的标准。
本国家标准计划针对当前空气中的重要病原微生物(含生物威胁因子),制定宏基因
组测序鉴定的标准化文件。对空气中微生物宏基因组测序的适用范围、相关的术语和定义、
基本要求、技术要求进行详细阐述,明确空气微生物采样、前处理方法、文库制备、无偏
向测序、数据分析和算法的规范化分析流程,保障我国空气微生物检测结果的可靠性,提
高对空气中生物安全因子的快速准确的监测能力,为重要病原微生物精准防控检测提供有
力支持,提升我国在病原微生物监测上的能力。
(四)主要工作过程
1、2020年2月至2020年6月,结合国家对空气中病原微生物检测的需要,标准起草单
位组织相关人员广泛收集了国内外空气中病原微生物宏基因组测序鉴定方法的应用现状
及技术发展趋势相关的标准、文献,了解了国内外相关技术动态,研究讨论了《空气中病
原微生物宏基因组测序鉴定方法》标准立项的必要性以及当前国内空气中病原微生物检测
存在的问题,完成了《空气中病原微生物宏基因组测序鉴定方法》项目建议书以及国家标
准草案的撰写,提交标准委员会秘书处,并通过标准委员会秘书处向国家标准化管理委员
会(简称国家标准委)提交了标准立项申请。
2、2020年7月,完成标准立项答辩,并通过专家评审。
3、2020年8月至2021年7月,成立标准起草工作小组,内部讨论了《空气中病原微生
物宏基因组测序鉴定方法》标准的起草工作,与会专家就《空气中病原微生物宏基因组测
序鉴定方法》标准(草案)进行了讨论,提出了宝贵的意见和建议。标准起草小组根据专
家意见进行了修改和完善,为起草工作做好充分准备。
4、2021年8月收到国标委发〔2021〕23号文件《国家标准化管理委员会关于下达2021
年第二批推荐性国家标准计划及相关标准外文版计划的通知》立项文件。
5、2021年9月至2021年12月,标准制定任务下达后,标准起草工作小组明确了任
务要求,安排了工作进度,进行《空气中病原微生物宏基因组测序鉴定方法》标准的起草
研制工作。在此期间,标准起草小组成员修改了标准文本初稿,召开讨论会确定了验证方
案和验证分工工作。
7、2022年1月至2022年3月,依据验证方案,利用气溶胶环境模拟仓模拟环境,对
空气样本进行采集、核酸提取、建库和数据分析。根据前期预实验结果,进行不同真实环
境下空气微生物的样本采集、提取和和数据分析,进一步扩大范围验证方法的代表性与适
用性。
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8、2022年4月,起草工作小组根据实验验证结果完善了标准文本,并形成了《空气
中病原微生物宏基因组测序鉴定方法》标准的编制说明。在此基础上,征求了专家意见,
起草组按照专家意见对标准内容进行了修改完善,完成了标准征求意见稿,提交至全国生
化检测标准化技术委员会。
二、国家标准编制原则和确定国家标准主要内容的论据
(一)标准编制原则
本文件编写格式按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分:标准化文件的结
构和起草规则》的格式要求进行编写。并参照GB/T6379.1-2004《测量方法与结果的准确
度(正确度与精密度)第1部分总则与定义》。
本文件编制的主要原则是先进性、科学性、实用性、规范性。制定标准时尽可能地做
到简化、统一、协调、优化;既考虑其先进性,也考虑其实用性、可行性和可操作性;既
符合国内外发展的需要,也结合国内目前的实际状况。
由于目前国内外尚未有空气中病原微生物宏基因组测序鉴定方法的标准可供参考,因
此,主要是在大量的实验和调研基础上进行本文件的制订。
(二)确定国家标准主要内容(如技术指标、参数、公式、性能要求、试验方法、检验规
则等)的论据(包括试验、统计数据)
1、本文件编写内容引用、参考我国与国外相关的法规、标准、文献包括:
(1)GB19489实验室生物安全通用要求
(2)GB50346生物安全实验室建筑技术规范
(3)GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
(4)GB/T18204.3公共场所卫生检验方法第3部分:空气微生物
(5)GB/T29859生物信息学术语
(6)GB/T30989高通量基因测序技术规程
(7)WS233病原微生物实验室安全通用准则
(8)WS598病原微生物实验室生物安全标识
(9)JJF1265生物计量术语及定义
(10)ISO20397-2:2021Biotechnology—Massivelyparallelsequencing—Part2:
Qualityevaluationofsequencingdata
(11)中华人民共和国卫生部,《人间传染的病原微物名录》(卫科教发[2006]15号)
(12)中华人民共和国传染病防治法(1989年2月21日第七届全国人民代表大会常
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务委员会第六次会议通过)
(13)李文姝.医学微生物学.第2版.高等教育出版社,2021
(14)Handelsman,J.;Rondon,M.R.;Brady,S.F.;Clardy,J.;Goodman,R.M.(1998).
"Molecularbiologicalaccesstothechemistryofunknownsoilmicrobes:Anewfrontierfor
naturalproducts".Chemistry&Biology.5(10):R245–R249
2、确定主要内容的依据
本文件规定了空气中病原微生物宏基因组测序鉴定方法的术语、原理、实验室工作条
件、仪器设备、试剂、试验步骤及测序结果分析。
2.1术语与定义确定的依据
根据GB/T30989、GB/T29859、ISO20397-2:2021和JJF1265分别给出了病原微生物
(pathogenicmicroorganism)、宏基因组(metagenome)、测序(sequencing)、大规模并行
高通量测序(massivelyparallelhigh-throughputsequencing)、鸟枪法测序(shotgun
sequencing)、文库(libary)和每百万序列数(readspermillion,RPM)的定义。
2.2实验室工作条件确定的依据
参考GB/T30989制定了实验室基本的工作条件,要求实验室应做到无菌操作,按照
功能划分为核酸提取区、文库制备区、扩增区、扩增产物分析区及其他区域。
参考中华人民共和国卫生部的《人间传染的病原微生物名录》(卫科教发[2006]15号),
将微生物按生物危害程度进行分类。当空气中可能存在第一类、第二类或第三类病原微生
物时,实验室的建筑、设施设备、个人防护装置的设计、安装及配置应满足GB50346的
规定以及WS233中相应的生物安全级别要求。
按照GB19489及WS233,对实验室人员的要求、样本的运输与管理、实验活动的管
理、生物安全监督检查、消毒与灭菌、废弃物的处置、应急预案与意外事故的处置进行特
殊要求。
按照WS598的要求,规定在实验室相应区域设置正确的标识。
2.3主要试剂确定的依据
宏基因组测序主要包括的试剂有核酸提取试剂、文库构建试剂、大规模平行扩增试剂
以及测序试剂。参照GB/T6682中一级水的要求规定了实验用水的要求。在实验过程中,
需采用国家标准物质作为质量控制标准。用于文库制备、扩增、测序的试剂可参考GB/T
30989。
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2.4主要仪器和设备性能确定的依据
(1)生物气溶胶采样器,流量可达300L/min。
在样本采集过程中,需尽可能采集到足量的微生物含量,达到建库需求。采用大流量
生物气溶胶采样器,可在较短时间内完成采样,减少微生物在采样过程中的损耗。通过调
研,比较了四种生物气溶胶采样器,其中气旋式采样器两种,流速分别为300L/min和325
L/min,采样量都在5mL;标准空气采样器Bio-sampler,速为12.5L/min以及撞击式采样
器28.3L/min,后两种采样器采集量都为20mL左右,综合考虑,选取了最大流速的气旋
式采样器用于采样。
(2)PCR仪:温度设置范围0℃~99℃;最大循环数99;升降温速度3℃/s。
满足基本PCR实验的需求。
(3)测序仪:测序通量大于1Gb,碱基识别质量大于20,碱基识别正确率大于99.9%。
本文件中测序的样品包括细菌、真菌、病毒、寄生虫等病原微生物,为保证数据的有
效性,需至少有50×测序深度,且满足碱基识别的准确率。
(4)冰箱:冷冻温度可达-80℃或以下。
保证样本的基本保存需要。
2.5检测方法确定的依据
在空气样本采集方面,本文件选用生物气溶胶采样器进行样品采集,故依据国标GB/T
18204.3的要求进行布点。
在核酸提取与质量控制方面,由于室内微生物含量低,故采用痕量核酸提取试剂盒进
行空气微生物核酸的提取。针对RNA病毒和DNA病毒,需采用不同的提取方法,详细提
取方法及步骤按照试剂盒说明书或参考标准文本中的附录A。
其它部分的检测方法依据对空气中病原微生物检测方法进行调研评估,搜集相关资料
及研究结果,结合文献,选取了具有代表性的采集及实验流程关键步骤和通用指标,以满
足标准制定的通用性、普适性和先进性要求。
三、主要试验(或验证)的分析、综述报告,技术经济论证,预期的经济效果
(一)主要试验(或验证)和分析
《空气中病原微生物宏基因组测序鉴定方法》的基本原理是通过空气生物气溶胶采样
器采集空气样本,结合核酸提取、文库制备及宏基因组无偏向测序得到微生物的DNA序
列、RNA序列等,并进行过程质量控制。使用序列比对软件将测序获得的微生物基因组序
列比对到微生物的参考基因组数据库上,获得数据库中比对到的微生物的基因组覆盖率及
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深度等信息,根据设定的阈值进而对样本中微生物进行鉴定。
1样品采集方法的模拟验证
根据空气中普遍存在的微生物种类,选取有代表性的细菌、真菌和病毒,在气溶胶环
境模拟仓内,利用气溶胶发生器将菌液以气溶胶的形式,喷散在仓内。采用安德森六级采
样器和滤膜采样器作为参比采样器,与生物气溶胶采样器同时对气溶胶环境模拟仓内的生
物粒子进行采集,确定采样时间,验证适宜的浓度范围。
1.1验证方法
1.1.1菌株制备
通过文献调研,以及考虑到实验的可操作性与生物安全性问题,细菌选取枯草芽孢杆
菌、大肠杆菌、粘质沙雷氏菌进行采集;真菌选取白色假丝酵母进行采集;病毒选取噬菌
体φ174进行采集。
对于细菌和真菌,选取验证用的微生物菌株,使用适宜的液体培养基过夜震荡培养。
将过夜培养的菌液8000g离心5min,弃去上清后,用磷酸盐缓冲液洗涤重悬。利用流式
细胞仪测定浓度后,用磷酸盐缓冲液稀释到(1×106~4×106)CFU/mL的浓度,作为产生微
生物气溶胶的溶液。
1.1.2气溶胶粒子采集
为保证实验的可重复性,在气溶胶环境模拟仓内,利用气溶胶发生器将菌液以气溶胶
的形式,喷散在仓内。气溶胶环境模拟仓体积长宽高1m×1m×1.5m,配置手套操作口3
处,内置扰流风机组,可以将注入气溶胶室内的生物气溶胶快速混匀扩散,实现2min内
快速混匀气溶胶,使得含微生物的粒子气溶胶分布均匀。气溶胶环境模拟仓的温度、湿度
和压强可手动调节并实时监测和记录。在实验验证过程中,为保证在采集过程中,微生物
仍处于适宜的环境内,调整气溶胶环境模拟仓的温度保持在(20±2)℃范围内,湿度保持
在(50±5)%RH范围内。为保证实验人员和环境的安全,气溶胶环境模拟仓内保持负压,
且压差保持在(60±5)Pa。
在气溶胶环境模拟仓内,将生物气溶胶采样器与参比采样器的采样口等高放置,并距
离气溶胶发生器0.5m~1m。采样器使用按照说明书要求进行。在采集前应注意使用无菌
水清洗采样器内部3次,并通过连续按下收集按钮3次,使用自动清洗功能3次。用微
生物气溶胶发生器在气溶胶环境模拟仓内发生微生物气溶胶,发生5min后,用粒子计数
器分别测量生物气溶胶采样器和参比采样器所在采样口的气溶胶粒子浓度,待两个粒子浓
度一致时,同时开启生物气溶胶采样器与参比采样器,采用各自设定的流速,采样一定时
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间(30min~60min)。
1.1.3微生物培养
将参比采样器的平板置于培养箱中正置培养。37℃培养18h后计数。将生物气溶胶采
样器的采样液一部分用于营养琼脂平板培养计数,其余采集液直接用于下一步核酸提取或
者12000g离心1min后吸净上清,重新悬浮于1mL缓冲液中。-20℃运输,保存时间不
超过24h,根据微生物特性,长期保存可置于-196℃~-80℃。
1.1.4核酸提取、建库与测序
采用痕量核酸提取试剂盒进行空气微生物核酸的提取,同时使用空气采集液作为阴性
对照同时进行提取,详细提取方法及步骤按照试剂盒说明书或参考标准文本中的附录A。
进行RNA的提取时,应注意提取时尽量在人少时进行,防止空气中RNA酶的污染,
所用设备和耗材也应是无RNA酶污染,并在使用前用紫外灯照射。对提取的核酸进行检
测与质量控制,使加入标准物质后的核酸总量达10ng~1µg。满足实验要求的DNA样本
应置于-20℃以下条件保存,一般不超过7天,长期保存应根据微生物特性置于
-196℃~-80℃;RNA样本应置于-80℃以下保存。取样一般不得超过3次,避免标本反复冻
融。
针对可能携带RNA病毒的样本,需用RNA反转录试剂盒进行RNA反转录成cDNA
的操作,包含一链和二链合成,形成双链cDNA。
根据样本种类及测序仪要求选择合适建库试剂盒,建库时加入国家标准物质作为质量
控制,按照建库试剂盒说明书对符合要求的核酸进行文库制备。同时为了得到高质量的测
序结果需要对并文库进行质量检测。可采用荧光染料或微流体等技术检测制备好的文库浓
度及文库片段长度分布。当文库浓度大于1ng/μL,文库片段在200bp~400bp,符合测序仪
要求时,文库质检合格。
将待测序合格文库选择合适的测序读长,并对每个样本添加标签,分别进行测序反应,
得到测序序列。同一批次样本测序应设置一个阴性对照,如有必要,设置阳性样本。测序
方法可参照标准文本中的附录B。
1.1.5数据质量控制
依据实验的数据统计和国内外发展水平,综合得出数据质量控制的具体流程。测序数
据量需要大于10Mb。对测序数据选择合适的数据质量控制软件,进行质量控制。控制流
程包括但不限于去除重复序列、去除低质量数据、去除接头序列等。合格测序数据应满足
以下条件:
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——碱基质量值大于等于20(即Q20:碱基识别错误率不大于1%)的占比在80%以
上;
——一条序列中不明确的碱基个数要小于5个;
——接头序列污染比例不超过1%;
——过滤低质量以及接头序列等后的剩余序列长度大于35bp。
1.1.6构建空气病原微生物参考基因组数据库
构建空气中病原微生物(包括细菌、病毒及真菌)数据库。从以下公共数据库的参考
数据库下载空气微生物基因组序列,用于微生物鉴定。
——国家基因库生命大数据平台(CNGB):/
——国家基因组科学数据中心:/
——美国国家生物信息中心(NCBI):/
——精选宏基因组数据库(curatedMetagenomicData):
/waldronlab/curatedMetagenomicData
——全球蛋白数据库(UniProt):/ebi-uniprot
——微生物基因组数据库:
——高精度的病毒数据库:/
——美国食品药品监督局监管级微生物序列数据库(BioProject231221):
/medical-devices/science-and-research-medical-devices/database-reference-
grade-microbial-sequences-fda-argos
1.1.7微生物序列比对及鉴定
(1)使用微生物比对分析软件,将样本的序列比对到数据库参考序列上,将比对结
果按照序列的数量进行排序。比对分析软件的详细操作可参考附录C中的示例。
(2)统计比对到空气微生物的目、科、属及种的序列数量,结合微生物基因组大小
的差异,首先将检测到的序列以每百万次序列数(RPM)为单位进行标准化,并计算相对
丰度、绝对丰度及覆盖度。当某些微生物(例如结核分枝杆菌、诺卡菌、某些真菌)的生
长特点和结构特点导致其核酸提取的难度较大时,测出的特异性序列数可能较少,判断是
病原微生物的最低阈值如下:
——细胞内细菌(如MTB和军团菌)的阈值大于1RPM;
——病毒的阈值大于3RPM;
——真菌的阈值大于5RPM;
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——逆转录病毒的阈值大于1000RPM;
当增加大规模测序的序列数量达到100RPM以上时,判读病原微生物的可信度更高。
(3)去除病原微生物假阳性。按照公式(1)计算样本RPMS与阴性对照RPMN的比率RPMr,
确定空气中病原微生物感染的状况。
……………(1)
式中:
RPMS——样本的每百万次序列数;
RPMN——阴性对照的每百万次序列数;
RPMr——样本的每百万次序列数与阴性对照的每百万次序列数的比率。
样本RPMS是阴性对照RPMN的10倍(即RPMr10)时可以报出。例如,在医院环
境中对空气微生物进行采样和宏基因组测序后,去除假阳性,当计算得到某病原微生物的
RPMr≥10时,可将该病原微生物纳入采样点的病原微生物检测报告中。
1.2验证结果
(1)空气中微生物总量及生物气溶胶采样器流量
为了确定基于宏基因组测序方法对空气中的微生物总量进行鉴定的灵敏度下限,使用
不同浓度的模拟菌株样本进行建库测序,与阴性样本作比较,获取能够显著区分阴性样本
的最低浓度,换算成空气中实际含量,即为该方法检测灵敏度,实际空气中的灵敏度检测
下限应达到500CFU/m³,按照常规采集1h的时间,所需的生物气溶胶采样器的流量需要
达到300L/min。按照公式(2)对模拟样本对应实际空气进行换算。
c1×v×t×e1×e2=c2×m………………..(2)
式中:
c1——单位体积空气含有的微生物数目,CFU/m³;
v——生物气溶胶采样器的流速,m³/min;
t——采集时间,min;
e1——生物气溶胶采样器的采集效率;
e2——采集液离心进行提取时的离心效率;
c2——空气微生物液体采集液离心富集后用于DNA提取时细菌的浓度,CFU/μL;
m——离心后的体积,mL。
(2)方法灵敏度
使用模拟大肠杆菌实现评估的具体过程如下,使用大肠杆菌培养物,用LBA进行系
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列稀释,制备已知浓度的大肠杆菌培养物。通过换算,在采样1h,使用流速为0.35m³/min
的生物气溶胶采样器,采集效率为60%,离心效率为90%的情况下,500CFU/m³的空气样
本对应模拟样本(1mL)的浓度为5CFU/μL。对大肠杆菌模拟采集样品(3CFU/μL,5
CFU/μL,7CFU/μL等梯度)进行核酸提取,宏基因组建库测序,利用宏基因组定量分析
方法,判断不同空气细菌总量下的宏基因组测序检出情况。结果如图1所示:每个梯度样
本做了三组重复,可以看到3CFU/μL的样本已经可以与阴性样本有显著区分,即灵敏度
达到了实际空气500CFU/m³以下。
图1大肠杆菌灵敏度实验结果
(3)方法敏感性和特异性
依据GB/T18204.3对于空气中溶血性链球菌检验的详细标准定义,拟以此检验标准及
检验结果作为对照,以肺炎链球菌作模拟样本进行建库测序,计算宏基因组方法实际检测
出样本的数量,及在阴性样本中鉴定出肺炎链球菌的数量进行计算。
依据国标GB/T18883-2002规定的室内空气不得超过2500CFU/m³,医院和人防工事
空气中细菌总数应小于1500CFU/m3,作为招待所、商场、俱乐部、影剧院、游乐场、地
铁车站公共场所等应小于4000CFU/m3,更有研究表明室内平均微生物浓度1700CFU/m³
左右,生物安全实验室则应具有不高于此标准的微生物浓度,因此本文件选择模拟肺炎链
球菌对应实际空气浓度在1700CFU/m³,通过上述换算得到实际建库样本浓度为17
CFU/μL。以培养检验结果作为对照,模拟制备该浓度下肺炎链球菌阳性样本10个,阴性
样本10个进行提取建库,所有测序结果符合数据质量控制标准(图2),根据宏基因组测
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序结果计算方法的敏感性和特异性,均可以达到100%(表1)。
图2肺炎链球菌菌株占比及覆盖度
表1肺炎链球菌实验敏感性特异性结果
实际阳性样本实际阴性样本
检测阳性样本100
检测阴性样本020
总计1020
(4)数据库构建
考虑到用于空气中重要病原微生物的鉴定的数据库需要涵盖细菌、病毒、真菌的全基
因组序列信息,并且应是具有代表性的空气病原可覆盖空气中常见病原的80%以上,根据
此原则,参考传染病防治法中甲、乙、丙类传染病能通过空气传播的病原、医学微生物学
中呼吸系统病原以及临床检验中常见病原,总共纳入了30种具有威胁的空气传播病原,
下载了对应1万多株病原的基因组序列,保证覆盖80%以上的空气中常见病原微生物,构
建了本地空气微生物病原数据库,如表2所示。
表2构建空气病原微生物数据库列表
病原名称拉丁名类别传染类别数据库条数
庖疹病毒herpesvirus病毒临检重要病原129
腺病毒Humanadenovirus病毒临检重要病原15
腮腺炎病毒Mumpsrubulavirus病毒丙类1
12
风疹病毒Rubellavirus病毒丙类1
甲型流感病毒Influenzaavirus病毒乙类130
麻疹病毒Measlesmorbillivirus病毒乙类1
非典型肺炎病毒Severeacuterespiratory
病毒乙类1
(SARS病毒)syndromecoronavirus
SevereAcute
新型冠状病毒RespiratorySyndrome病毒重大影响92
Coronavirus2
中东呼吸综合征
MiddleEastRespiratory
冠状病毒病毒重大影响1
SyndromeCoronavirus
(MERS)
Pseudomonas
铜绿假单胞菌细菌临检重要病原800
aeruginosa
Acinetobacter
鲍曼不动杆菌细菌临检重要病原800
baumannii
金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus细菌临检重要病原800
Streptococcus
肺炎链球菌细菌临检重要病原800
pneumoniae
临检重要病原,医学微生
肺炎克雷伯菌Klebsiellapneumoniae细菌800
物学
麻风分枝杆菌Mycobacteriumleprae细菌丙类,医学微生物学7
鼠疫耶尔森菌Yersiniapestis细菌甲类474
Pseudomonas
嗜肺军团菌细菌医学微生物学800
aeruginosa
流感嗜血杆菌Haemophilusinfluenzae细菌医学微生物学748
炭疽杆菌Bacillusanthracis细菌乙类247
脑膜炎球菌Neisseriameningitidis细菌乙类,临检重要病原800
Mycobacterium乙类,临检重要病原,医
结核分支杆菌细菌800
tuberculosis学微生物学
百日咳鲍特菌Bordetellapertussis细菌乙类,医学微生物学800
Corynebacterium
白喉棒状杆菌细菌乙类,医学微生物学258
diphtheriae
布鲁氏菌Brucellasubtilis细菌乙类,重大影响775
肺炎衣原体Chlamydiapneumoniae衣原体临检重要病原13
鹦鹉热衣原体Chlamydiapsittaci衣原体临检重要病原70
耶氏肺孢子菌Pneumocystisjirovecii真菌临检重要病原3
烟曲霉Aspergillusfumigatus真菌临检重要病原19
白色念珠菌Candidaalbicans真菌临检重要病原66
Mycoplasma
肺炎支原体支原体临检重要病原185
pneumoniae
(5)数据质量控制分析
15份大肠杆菌模拟样本及20份肺炎链球菌阳性样本使用MGIEasy微生物DNA提取
13
试剂盒进行提取,MGIEasy微量DNA文库制备试剂盒进行建库,BGISEQ2000平台进行
测序,使用PE100进行测序。测序后35份样品的数据质量都满足Q20≥80%,一条序列中
不明确的碱基比例小于1%,接头污染比例不超过1%及过滤后剩余序列的长度大于35bp。
同时满足阴性样本质量控制标准:菌株占比不高于5×10-11及基因组覆盖度不高于10%。阳
性阈值判定标准:基因组覆盖度大于70%及序列占比高于3×10-9。
2真实环境下空气采集方法的验证
按照上述结果的分析,确定具体的验证方法,对不同真实环境中的空气进行样本采集。
在空间场地的选择上,面积方面分为面积50平方米以下、50平方米到200平方米和200
平方米以上三类;场所类型方面,室内选择办公场所、家庭环境和酒店客房,室外选择北
京、武汉和深圳。
2.1验证方法
将建立的空气宏基因组测序鉴定方法应用到检测实际空气中是否存在重要空气病原,
在武汉火眼实验室,深圳国家基因库进行了真实环境下的空气采集及方法学验证,具体的
验证实验及分析方法可见如下流程图:
图3真实空气采样验证方法流程图
按照GB/T18204.3的要求进行布点,具体如下:
a)室内面积不足50m³的设置1个采样点,50m³~200m³的设置2个采样点,200m³
以上的设置3个~5个采样点。
b)采样点按均匀布点原则布置,室内1个采样点的设置在中央,2个采样点的设置在
14
室内对称点上,3个采样点的设置在室内对角线四等分的3个等分点上,5个采样点的按
照梅花布点,其他的按均匀布点原则布置。
c)采样点距离地面高度1.2m~1.5m,距离墙壁不小于1m。
d)采样点应避开通风口、通风道等。
每个采样点重复采样3次。生物气溶胶采样器放在距离地面1.2m~1.5m的位置,将
获得的5mL~7mL采集液直接用于下一步核酸提取或者12000g离心1min后吸净上清,
重新悬浮于1mL缓冲液中。-20℃运输,保存时间不超过24h,根据微生物特性,长期保
存可置于-196℃~-80℃。
2.2验证结果
2.2.1真实样本采样点设计
在新冠疫情爆发期间,在武汉实验室1和深圳实验室2采集了共13个真实空气样本,
其中武汉火眼实验室的办公区,更衣室,休息室及实验室各区域12个,深圳国家基因库
厕所1个,具体采样点信息见表3所示。
表3真实空气采样点信息
地点备注
深圳实验室2厕所
办公区
103更衣室
104休息室
106试剂配制区消杀前
126试剂配制区消杀前
128qPCR扩增区消杀前
武汉实验室1
121灭活室消杀前
108信息校对室消杀前
107分液室消杀前
127自动化提取室消杀前
106试剂配制区消杀后
126试剂配制区消杀后
2.2.2真实空气样本宏基因组建库测序
15
对13份样本进行了宏基因组建库及测序,首先使用微生物分类软件将产生的序列比
对通用数据库中,鉴定所得的微生物归属于包含肠杆菌科在内的6个属,各样本中的物种
数目在13到37种之间。鉴定结果并未发现可通过空气传播的病原细菌,真菌及病毒,验
证了真实采样的方法可行性(图4)。
同时,将13份样本产出的数据比对到了本文件所构建的包含30种空气病原的数据库
中,根据设定的阈值标准,发现本次采样阴性对照样本序列占比为3.2×10-11,基因组覆盖
度为5.3%,说明本批次实验可靠。以基因组覆盖度70%与序列占比3×10-9作阳性阈值进
行阳性结果判定,也未发现可通过空气传播的病原细菌,真菌及病毒(图5)。
图4空气样本测序比对结果
16
图5空气样本比对到所构建数据库阈值结果
经过以上试验全面验证标准编写条款的适用性和可行性,验证结果来看,满足标准编
写要求。
(二)经济与社会效益
随着人们对环境微生物认识的不断加深,在空气监测中,空气微生物的重要性正在不
断凸显。基于测序技术检测环境微生物将直接与人们生活息息相关。2019年底新爆发的新
冠病毒可以通过空气传播,如果能够运用空气微生物鉴定方法检测空气中的病原,即可以
提前预防,掐断传播途径。以及爆发的布鲁氏菌是通过工厂排气筒排出,从而感染了周围
人群。使用本文件可随时检测空气中的有害微生物,避免大范围的病原传播,及早发现及
时清洁。
在经济效益方面,本文件的建立和普及,可为空气中微生物监测提供标准化的方法,
对空气中微生物的种类与丰度进行定性、定量,是科学研究与实践应用的基础,可服务于
相关科学研究和检测。此外,通过开发空气中微生物宏基因组测序的数据库,提供检索服
务。社会效益方面,通过标准的制定发布,能够使得基于测序的空气微生物检测技术流程
做到规范化,统一化,进而在样本的可靠度和空气病原检测的准确性方面有显著的提升,
保障我国空气微生物检测结果的可靠性,提高对空气中生物安全因子的快速准确的监测能
力,为重要病原微生物精准防控检测提供有力支持,提升我国在病原防控上的精准防控能
力,让人民生活安全性得以提升,为全民健康提供有力的保障和支持。
四、采用国际标准和国外先进标准的程度,以及与国际、国外同类标准水平的对比情况,
或与测试的国外样品、样机的有关数据对比情况
本文件没有采用国际标准,本文件在制定过程中未查到同类国际标准。
本文件未采用国内标准,本文件在制定过程中未查到针对性的国家标准、行业标准和
地方标准。目前有一项推荐性国家标准GB/T40226已于2021年12月实施。该标准为针
对环境中所有微生物提出的通用方法、流程及相关要求。具体内容包括检测方法的原理、
试剂、设备、仪器、通用实验流程及步骤,并附粪便、土壤、水体样本的采集、保存和运
输方法。本文件与前述标准一脉相承,在其基础上提出适用于空气中病原微生物鉴定的具
体方法、特别要求及通过实验验证的关键指标及参数设置,包括空气样本的采集、核酸提
17
取与质量控制、文库构建及测序、测序结果分析。对前述标准形成良好补充,可与前述标
准视为同系列标准。
本文件的总体技术水平属于国内领先水平。
五、与有关的现行法律、法规和强制性国家标准的关系
本文件与相关法律、法规、规章及相关标准协调一致,没有冲突。
六、重大分歧意见的处理经过和依据
无。
七、国家标准作为强制性国家标准或推荐性国家标准的建议
建议国家标准《空气中病原微生物宏基因组测序鉴定方法》作为推荐性标准颁布实施。
八、贯彻国家标准的要求和措施建议(包括组织措施、技术措施、过渡办法等内容)
建议本文件在批准发布6个月后实施。
本文件发布后,应向有空气中病原微生物鉴定需求的各单位如医院、检测实验室等宣
传、推荐执行本文件。
九、废止现行有关标准的建议
无。
十、其他应予说明的事项
无。
18
国家标准
《空气中病原微生物宏基因组测序鉴定方
法》
(征求意见稿)
编制说明
标准起草小组
2022年03月
1
《空气中病原微生物宏基因组测序鉴定方法》
国家标准编制说明
(征求意见稿)
一、工作简况
(一)任务来源
本国家标准根据国标委发〔2021〕23号文件《国家标准化管理委员会关于下达2021
年第二批推荐性国家标准计划及相关标准外文版计划的通知》,正式确认立项,项目计划
编号为20213397-T-469,名称为《空气中病原微生物宏基因组测序鉴定方法》。本项任务由
中国计量科学研究院提出,由全国生化检测标准化技术委员会归口。
(二)协作单位
(三)目的和意义
悬浮于大气中的含有细菌、真菌、病毒或生物大分子的生物气溶胶粒子,与人类的生
命健康密切相关。空气中含有大多数呼吸道病毒(如流感病毒、腺病毒等)在内的约五百
多种致病性微生物,其中可经气溶胶传播的至少有100多种,占全部传播途径的首位,对
人类健康、社会经济发展造成了严重的威胁。被病原微生物污染的空气,常可成为污染的
来源或媒介,引起传染病流行。因此,进行空气中病原微生物的检测,建立空气病原微生
物的鉴定方法,对于日常环境、公共场所及医疗卫生环境的空气监测具有适用性,对于传
染病预防与控制以及环境的卫生学监督与保护具有重要的意义。
临床上传统的病原鉴定主要以培养和生化检测为基础,随着大规模并行高通量测序技
术的不断进步,宏基因组测序(metagenomicsnext-generationsequencing,mNGS)极大的
提高了病原检测的效率,并有助于识别难以培养的病原微生物。研究表明,当病原为病毒、
厌氧菌和真菌时,宏基因组测序诊断传染病的敏感性和特异性都显著优于传统培养方法。
重要的是,宏基因组测序可以确定传统方法无法确定的病原,该技术规避了绝大部分微生
物不能培养、痕量菌无法检测的缺点。由于微生物的多样性、种类复杂性以及较快的变异
性,通过高通量、快速、准确的宏基因测序方法进行鉴定,可以实现病原微生物的鉴定分
类与溯源。
目前DNA测序和宏基因组学方法虽已被用于土壤和水体环境微生物研究,但将其应
用于空气微生物的检测尚未标准化,存在样品DNA含量少、传统方法难以获得足够DNA
2
进行测序等技术困难。国外也尚未制定相关的标准。
本国家标准计划针对当前空气中的重要病原微生物(含生物威胁因子),制定宏基因
组测序鉴定的标准化文件。对空气中微生物宏基因组测序的适用范围、相关的术语和定义、
基本要求、技术要求进行详细阐述,明确空气微生物采样、前处理方法、文库制备、无偏
向测序、数据分析和算法的规范化分析流程,保障我国空气微生物检测结果的可靠性,提
高对空气中生物安全因子的快速准确的监测能力,为重要病原微生物精准防控检测提供有
力支持,提升我国在病原微生物监测上的能力。
(四)主要工作过程
1、2020年2月至2020年6月,结合国家对空气中病原微生物检测的需要,标准起草单
位组织相关人员广泛收集了国内外空气中病原微生物宏基因组测序鉴定方法的应用现状
及技术发展趋势相关的标准、文献,了解了国内外相关技术动态,研究讨论了《空气中病
原微生物宏基因组测序鉴定方法》标准立项的必要性以及当前国内空气中病原微生物检测
存在的问题,完成了《空气中病原微生物宏基因组测序鉴定方法》项目建议书以及国家标
准草案的撰写,提交标准委员会秘书处,并通过标准委员会秘书处向国家标准化管理委员
会(简称国家标准委)提交了标准立项申请。
2、2020年7月,完成标准立项答辩,并通过专家评审。
3、2020年8月至2021年7月,成立标准起草工作小组,内部讨论了《空气中病原微生
物宏基因组测序鉴定方法》标准的起草工作,与会专家就《空气中病原微生物宏基因组测
序鉴定方法》标准(草案)进行了讨论,提出了宝贵的意见和建议。标准起草小组根据专
家意见进行了修改和完善,为起草工作做好充分准备。
4、2021年8月收到国标委发〔2021〕23号文件《国家标准化管理委员会关于下达2021
年第二批推荐性国家标准计划及相关标准外文版计划的通知》立项文件。
5、2021年9月至2021年12月,标准制定任务下达后,标准起草工作小组明确了任
务要求,安排了工作进度,进行《空气中病原微生物宏基因组测序鉴定方法》标准的起草
研制工作。在此期间,标准起草小组成员修改了标准文本初稿,召开讨论会确定了验证方
案和验证分工工作。
7、2022年1月至2022年3月,依据验证方案,利用气溶胶环境模拟仓模拟环境,对
空气样本进行采集、核酸提取、建库和数据分析。根据前期预实验结果,进行不同真实环
境下空气微生物的样本采集、提取和和数据分析,进一步扩大范围验证方法的代表性与适
用性。
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