大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化

大肠杆菌表达■组蛋白的超声破碎及纯化大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化一可溶性蛋白的纯化（一）菌体的破碎仪器与材料：-801冰箱；超声波细胞破碎仪；50mMPBS或50mMTris-HClpH7.5;50ml离心管；冷冻高速离心机方法2.1反复冻融2.1.1收集菌液500ml,等分10份，4000r/min4^离心15min,弃上清。2.1.2菌体沉淀中加入相同菌液体积的50mMPBS或50mMTris-HCl（选择使蛋白稳定的缓冲液和pH）重悬洗涤一次。2.1.3然后按原菌液体积的1/4加入缓冲液重悬菌体，并加入蛋白酶抑制剂PMSF和EDTA带His标签不加）,PMSF终浓度为100四/ml,EDTA的终浓度为。取205重悬菌液进行电泳，检测蛋白表达的情况（是否表达，是可溶性表达还是包涵体表达）。2.1.4将菌液（经检测有表达）在-80度冰冻，室温融解，反复几次（反复冻融三次），由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。2.2超声波处理（对超声波及热敏感的蛋白慎用）2.2.1将反复冻融的菌液（必要时可加入1mg/ml溶菌酶，缓冲液pH>8.0，加入后需静置20min），进行超声破碎，超声条件：400W,工作5秒，间隔5秒，重复一定次数，（根据我们的仪器找出一个比较好的工作条件）。直至菌体溶液变清澈为止，大约花费时间。2.2.2取少量经超声破碎后的菌液，10000rpm离心10分钟，分别对上清和沉淀进行检测，并用全菌作为阳性对照，检测菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。注意事项：（1）超声破碎具体条件可根据实验情况而定，要掌握好功率和每次超声时间，降低蛋白被降解的可能。功率大时，每次超声时间可缩短，不能让温度升高，应保持在4度左右，超声时保持冰浴。菌体破碎后总蛋白浓度的测定可用Bradford法或者紫外吸收法。可通过SDS电泳观察菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。二包涵体蛋白的纯化1菌体的破碎(加溶菌酶处理包涵体效果可能不好，包涵体中总是有残留的溶菌酶，你看看有没有不加溶菌酶的，这个先保留好了)1.1仪器与材料：超声波细胞破碎仪；20mMPBS或20mMTris-HClpH7.5；裂解液bufferA；溶菌酶10mg/ml；50ml，15ml离心管；令冻离心机1.2方法收集菌液500ml，等分1。份，4000r/min4^离心15min,弃上清。(2)菌体沉淀中加入相同菌液体积的20mMPBS或20mMTris-HCl(选择使蛋白稳定的缓冲液和pH，一般为7.5-8.0)，重悬洗涤2-3次，弃掉上清。(3)然后沉淀按原菌液体积每500ml以15ml预令的裂解液bufferA重悬。(有的文献为每克湿菌加4ml-10ml裂解液)(4)每毫升悬液中加入100ul10mg/ml溶菌酶(即溶菌酶终浓度1mg/ml)。在冰上孵育15min对15ml悬液进行超声破碎，超声条件：400W，工作5秒，间隔5秒，重复一定次数。超声破碎时保持冰浴。具体条件可根据实验情况而定。4。。4000rpm/min离心20分钟所得沉淀即为包涵体。注意事项：融合蛋白的分子量如果大于150KD时，用超声波破碎很容易将目标蛋白打碎而造成降解，故可用溶菌酶先做处理.2包涵体的洗涤将包涵体沉淀重悬于含有适量脲(1-4M)的BufferA中，每克湿重加4-6ml洗涤液。超声波处理5秒打碎沉淀，继续用注射器吸入并挤出悬液，重复数次，4°C涡旋悬液30mino或者高速搅拌悬液10min。4C,4000rpm/min离心15分钟。重复上述操作2次至上清液透明无色。将包涵体沉淀重悬于BufferA,4C,4000rpm/min离心15分钟，弃掉上清。注意事项：包涵体洗涤时增加NaCl浓度到0.5M，有助于包涵体中杂蛋白的溶解。经提取洗涤后得到的包涵体，由还原SDS电泳结合光密度扫描可知包涵体中目标蛋白的含量。包涵体洗涤是纯化极重要的一步，不同培养条件下收集的菌液经洗涤可得到不同的纯度。50mMTris-HClpH8,0.2mMEDTA,100mMNaCl,1%Tritonx-100(或2%脱氧胆酸钠)1mMDTT1mMPMSF10mg/ml大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化用通常的洗涤方法，如果包涵体达不到所需的纯度，可试用分级沉淀法初纯包涵体，步骤如下：菌体破碎后将所得的包涵体悬浮于含6mol/L盐酸胍的BufferA中，4C涡旋悬液30min,4000r/min离心20min，上清进行分级沉淀。取一小部分上清用BufferA稀释到盐酸胍浓度为4M,然后4C涡旋悬液15min，静置30min,4000r/min离心20min，上清继续稀释到3M，重复上面操作一直到2M，把每次沉淀和上清跑SDS电泳分析，看目标蛋白在哪个盐酸胍浓度下纯度最高。摸索好条件后，直接将剩余上清直接用BufferA稀释到所需的盐酸胍浓度，然后4C涡旋悬液15min，静置30min,4000r/min离心20min，沉淀既为分级沉淀后的包涵体。超声破碎在建立表达条件过程中，小量制备样品可用小型超声细胞粉碎仪。离心1.0〜1.5ml诱导后的菌液收集菌体，然后视菌体的量加入300〜500ml的缓冲液重悬细胞，然后置于冰上超声破碎。因很多实验室有自己的小型超声粉碎器各个操作不尽相同，具体操作参考仪器说明书。常规操作步骤如下(以100ml培养液为例)：(1)100ml诱导后的菌液(OD600=1.2左右)，12000rpm,4^离心2min，收集菌体。(2)加入预冷的缓冲液50ml,重悬细胞洗涤菌体一次，12000rpm,4^离心2min,收集菌体；常规的操作所使用的缓冲液多为PBS或者Tris-NaCl,针对不同的载体和纯化方法，选择相应的缓冲液。对于一些蛋白酶敏感的目的蛋白，可以在整个操作过程中加入一些蛋白酶抑制剂。(3)向沉淀中加入15ml的缓冲液同上(若菌体太浓，可加倍)，充分悬浮，将菌悬液装在一个玻璃小烧杯中，置于冰水混合物中。破碎：将用缓冲液洗涤过的超声探头伸入到菌液中，不要接触烧杯底部，每处理30sec间隔1min使菌液冷却，输出强度为5〜6,频率为60〜70%。(5)分离上清和沉淀：12000rpm,4^离心20min，分离上清和沉淀。(6)SDS分析蛋白表达情况。(7)准备纯化蛋白。超声破碎注意事项与一些小的改进：(1)破碎完全的判断：超声前菌悬液是浑浊的，超声完全后变的透明、清澈。(2)如果超声时出现黑色沉淀，说明超声功率太强。(3