多重脑震荡后大鼠中缝核团内5-羟色胺的表达

多重脑震荡后大鼠中缝核团内5-羟色胺的表达

运动脑振动（src）是目前常见的运动损伤类型，尤其是在运动员接近和竞争激烈的体育比赛项目中。虽然SRCC多数为轻型头部损伤,但在一次脑震荡(cerebralconcussion,CC)损伤后一部分伤者会出现头痛、头晕、注意力不集中、记忆不良等学习记忆等方面的障碍;如果运动员经历CC后还没有完全恢复,又遭受第二次CC后会出现更严重的神经与学习记忆方面的障碍,甚至死亡。美国运动医学界将其定义为二次冲击综合征(second-impactsyndrome,SIS)。由于目前关于CC的机理仍然不清,故临床和运动医学也难以对SIS的机理进行合理的解释,对于SRCC和SIS后学习认知行为相关脑区的神经病理学变化研究也未见报道。5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)是脑内重要的神经递质,它对认知功能、交感神经系统的兴奋、人体运动功能、疼痛和食欲等方面均起着重要的调节作用。国内外一些实验研究及临床证据表明:5-HT能神经系统在脑损伤后发生了紊乱,主要表现为脑损伤后脑内不同脑区5-HT合成和/或释放增多,或5-HT代谢增强等。但这些变化仅仅来自于一次脑损伤的研究结果,它是否适用于SRCC和SIS还有待于进一步研究。所以,本实验通过复制多重脑震荡(MCC)大鼠模型,应用免疫组织化学技术研究MCC后脑干中缝核团内5-HT免疫阳性产物及合成5-HT的限速酶-色氨酸羟化酶(TPH)的表达变化,旨在为进一步研究5-HT是否对MCC和SIS后的认知障碍产生影响提供形态学依据。材料和方法1.动物供应中心健康雄性SD大鼠56只,体重295±15g,购自昆明医学院动物供应中心。随机分为7组:对照组,多重脑震荡伤后1、2、4、8、16、24d组(每组n=8)。2.模型的建立与发展采用于建云等研制的金属单摆打击装置给SD大鼠额顶部连续三次钝性打击(1次/d,连续3d打击),复制出具有三次一过性脑功能障碍的MCC大鼠模型。3.抗生物素活性各组动物定时用1%戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉,含4%多聚甲醛的磷酸缓冲液(PB)灌注固定取脑,连续冰冻切片,厚15μm。用抗5-HT、抗TPH抗体进行免疫组织化学SP法染色,具体步骤如下:用柠檬酸盐抗原修复液(pH6.0)进行抗原热修复,一抗为兔抗5-HT多克隆抗体(1∶2000,购于第四军医大学组胚教研室)或绵羊抗TPH多克隆抗体(1∶1200,Chemicon公司),4℃孵育24h;生物素标记的二抗(羊抗兔IgG,1∶150,迈新公司,室温孵育15min)或(兔抗绵羊IgG,1∶300,KirkegaardandPerryLabs,室温孵育1h);链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液(SP,1∶150,迈新公司),室温孵育10min;DAB显色,室温孵育10min。空白对照用0.01mol/L的PBS代替一抗;置换实验用正常羊血清或小牛血清代替一抗,其余步骤不变。4.量脑干中缝核团内5-ht和tph阳性反应物的平均粒度值应用HPIAS-1000高清晰图像文分析系统分别测量脑干中缝核团内5-HT能神经元胞浆内5-HT和TPH阳性反应物的平均灰度值(注:灰度值与所测物质的浓度成反比,即灰度值越大,表示所测物质的浓度越小)。5.单因素方差分析及q检验应用SPSS11.0软件包对图像分析测定的结果进行单因素方差分析及两两比较的q检验,数据采用均数±标准误(x¯±Sx¯)(x¯±Sx¯)表示,凡P<0.05被认为有统计学意义。结果1.各组tph免疫阳性反应比较TPH免疫阳性产物的表达主要定位于胞浆内,呈棕黄色,胞核不着色。阴性对照实验未见着色,说明此免疫组化实验具有特异性。MCC后1d组,中缝背核(dorsalraphenucleus,DR)内TPH免疫阳性反应的产物有所升高,2d组达到高峰,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。正中中缝核(medianraphenucleus,MnR)内TPH免疫阳性反应产物在伤后1d时明显升高(P<0.01);2d组阳性反应最强(P<0.01),4、8d组阳性反应有所减弱,但仍明显高于对照组(P<0.05);24d组基本恢复正常。中缝大核(raphemagnusnucleus,RMg)内TPH免疫阳性反应产物在伤后1、2、4、8d升高,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。其中以1d组阳性反应最强(P<0.01),16、24d组基本恢复。中缝苍白核(raphepallidusnucleus,RPa)内TPH免疫阳性反应产物在伤后1、2、4d升高,与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05),其中以4d组阳性反应最强(P<0.01),24d组基本恢复(表1,Figs.1A-1F)。2.皮肤免疫反应阳性产物的表达5-HT免疫阳性产物的表达主要定位于胞浆内,呈棕黄色,胞核不着色。阴性对照实验未见着色,说明此免疫组化实验具有特异性。与对照组比较,中缝背核内5-HT免疫阳性反应产物的表达在伤后1d时明显升高(P<0.05),2d达到高峰(P<0.01),4、8d组有所减轻,但仍均高于对照组(P<0.05),16、24d组与对照组相比差异无统计学意义。正中中缝核内5-HT免疫反应阳性产物在伤后2、4d时高于对照组(P<0.05),其中2d组达到高峰,16、24d组基本恢复正常。中缝大核和中缝苍白核内5-HT免疫反应阳性产物的表达也在伤后出现升高,但各损伤组与对照组相比差异均无统计学意义(P>0.05,表2,Figs.1G-1L)。中缝小体中5-ht的表达国内外许多研究表明:脑损伤后不同时间内脑组织内5-HT含量升高;血浆、脑脊液中5-HT的浓度明显升高。但是,这些实验结果仅针对开放性脑损伤。于是,有学者对实验性脑震荡脑内5-HT递质的变化进行了研究,发现在脑震荡后早期,脑组织内5-HT含量升高。本实验所显示的MCC后早期大鼠脑干中缝核团内TPH和5-HT免疫反应阳性产物增强的结果与以往的报道相似,进一步证实了脑损伤后早期脑干内5-HT能神经元的活性确实有所增强。关于脑损伤后早期脑干中缝核团内TPH和5-HT增高的原因,可能是脑损伤后神经元过度兴奋的一种反应。有资料表明,脑损伤时作用于神经系统的瞬间机械暴力达到一定程度,导致广泛的神经元过度兴奋,Ca2+通道开放,大量细胞外的Ca2+迅速进入细胞;同时由于损伤导致局部组织缺血缺氧,能量代谢障碍,Na+-K+-ATP酶活性下降,ATP酶耗竭,钙泵活性受到抑制,使细胞内Ca2+的转出减少。这些因素共同作用造成细胞内Ca2+处于超载状态。一方面,大量的Ca2+可促使突触前成分释放5-HT增多,突触前终末内5-HT的含量减少,从而通过反馈调节机制使胞体中的5-HT的合成进一步增加;另一方面,神经元内TPH的活性也可被Ca2+激活而提高,加速了5-HT的合成,造成5-HT大量堆积。本实验结果中,中缝背核(DR,B7群)和正中中缝核(MnR,B6+B8群)神经元内TPH和5-HT免疫反应阳性产物的表达均在伤后2d达到高峰,说明MCC后DR和MnR内TPH蛋白表达增强,活性增高,进而使5-HT合成增多。中缝大核(RMg,B3群)和中缝苍白核(RPa,B1群)神经元内TPH免疫反应阳性产物的表达也分别在伤后1d和4d最强,而RMg和RPa神经元内5-HT免疫反应阳性产物的表达在伤后变化不明显。我们推测这种阳性反应表达的非同步性可能是由于合成5-HT的前体氨基酸-色氨酸在RMg和RPa内含量不足,或者是在RMg和RPa中表达的TPH不能完全发挥其生物学活性,而使RMg和RPa内5-HT表达的增高不明显所致。TPH作为合成5-HT的限速酶,在反应过程中需要有辅酶四氢生物喋呤(BH4)的参与,如果BH4不足或缺失,TPH将不能完全催化底物生成足够的产物。RMg和RPa中TPH的表达高于5-HT的表达,这种不一致性,究竟是由于RMg和RPa内色氨酸摄取不足还是BH4的缺乏所致,其机理还有待于进一步深入研究。近年来,国外学者还在人和大鼠脑内发现有与5-HT释放有关的蛋白质-5-HT转运体(5-HTT),它在调节5-HT能神经元活动方面也有重要作用。5-HTTmRNA只分布在中缝5-HT神经元胞体内,在胞体中合成5-HTT后经轴浆运输到神经末梢,在Na+介导下将释放到突触间隙的5-HT递质重吸收到突触前膜内存储。因此,5-HTT被认为是一种不需要Ca2+介导的调节神经递质释放的物质,它在神经末梢对5-HT的释放-再吸收循环发挥重要作用。目前,对脑内5-HTT