花生四烯酸细胞色素p450cyp表氧化酶代谢产物对牛主动脉内皮细胞的影响

花生四烯酸细胞色素p450cyp表氧化酶代谢产物对牛主动脉内皮细胞的影响

许多人类疾病都与血管生成有关。血管生成与个体发育、新生儿组织形成、伤口愈合、局部组织缺氧和其他生理病理过程非常重要。因此研究新的血管生成因子及其作用机制具有重要的临床意义。内皮细胞的增殖、趋化和迁移是血管形成过程中必需的起始和中心环节,因此研究血管生成促进因子必须研究其对血管内皮细胞及其功能有何影响。血管内皮细胞发挥其功能是通过其合成产生的各种生物活性因子来实现的,其中包括多种血管舒张物质,如一氧化氮(nitricoxide,NO)和前列环素(prostacyclin,PGI2)等。除NO和PGI2外,近年来发现内皮细胞通过细胞色素P450(CYP)表氧化酶代谢花生四烯酸(arachidonicacid,AA)生成另外一种扩血管因子——表氧二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoicacid,EET),这种因子通过激活钙离子敏感的钾通道,使平滑肌细胞处于超极化状态而扩张血管。对AA的研究已有多年,最为人们熟知的是通过环氧化酶和脂质氧化酶途径代谢,而经表氧化酶(即AA代谢的第三条途径)代谢产生四种EET(5,6-、8,9-、11,12-和14,15-EET)。与内皮细胞中的扩血管物质NO和PGI2相比,EET对血管张力的调节在某些病理状态下可能更有意义,目前已知NO和PGI2均能显著改善缺血和促进血管生长,而CYP表氧化酶和EET是否具有促进血管生成的作用以及它们对血管内皮细胞的增殖、趋化、迁移的影响目前尚不清楚。本研究拟通过在内皮细胞给予外源性的EET或表氧化酶基因的过度表达研究它们对内皮细胞增殖、趋化、移行、类微血管结构生成和血管生成的影响。材料和方法一、实验材料1.菌株和抗cyp-843质粒构件:重组腺相关病毒(recombinantadeno-associatedvirus,rAAV)包装质粒pXX2、腺病毒辅助质粒pXX6、真核表达载体pXXUF1(含绿色荧光蛋白序列)由美国Pittsburgh大学分子遗传及生物化学系XiaoXiao博士馈赠。工程菌株E.coliDh5α由我科心血管研究室保存,293细胞购自ATCC(美国)。CYP2J2cDNA由美国国立卫生部Zeldin博士馈赠,CYP102F87V突变DNA、CYP2C11OR[由大鼠CYP2C11与大鼠细胞色素P450氧化还原酶(CYPOR)融合构建]、抗CYP2J2抗体和抗CYPF87V抗体由美国Vanderbilt大学Capdevila教授馈赠。CYP2J2为来源于人的表氧化酶,可以代谢花生四烯酸产生5,6-、8,9-、11,12-和14,15-EET,CYPBM3F87V选择性增加内源性14,15-EET的产生,CYP2C11OR主要代谢生成11,12-EET,同时也产生8,9-EET和14,15-EET。2.血管内皮生长因子和血管内皮生长因子各种限制性内切酶、T4DNA连接酶,碱性磷酸化酶购自宝生物工程大连有限公司,核酸分子量参照物购自NewEnglandBiolabs,质粒大量提取试剂盒(WizardPlusMaxiprepsDNAPurificationSystem)为Promega公司产品,DNA快速纯化回收试剂盒购自北京原平皓公司,蛋白酶K购自Sigma公司,胰蛋白胨和酵母提取物购自美国DIFCO公司。牛主动脉(武汉市血清制品厂),胰酶、DMEM、胎牛血清、Trizol(Gibco),10%DMEM[含10%胎牛血清、50mg/L肝素钠、0.146g/L的L-谷氨酰胺、100μ/ml青霉素、100μ/ml链霉素]。噻唑蓝(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbro-mide,MTT)、碘化吡啶、8,9-EET、11,12-EET、14,15-EET、HEPES、MEK抑制剂(2′-amino-3′-methoxyflavone,PD98059)、apigenin、PI3K抑制剂[2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one,LY294002]、H7、土温20、苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonylfluoride,PMSF)、抑肽酶、表氧化酶抑制剂(17-octadecynoicacid,17-ODYA)、一氧化氮合酶抑制剂L-单甲基精氨酸(NG-methyl-L-arginine,NG-methyl-L-arginine,L-NMMA)(Sigma,St.Louis,MO)。血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)购自美国CollaborativeBiomedicalProductsA,兔抗表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)和磷酸化EGFR购自CellSignalingTechnology,兔抗PI3K(SantaCruz,California),兔抗-ERK1/2(p44/42MAPK)和兔抗-phospho-ERK1/2(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA)。Matrigel(B&DBiosciences,德国),PVDF膜(Dassel,德国),蛋白裂解液(500mmol/LTris.Hcl-pH8.0、150mmol/L氯化钠、0.02%叠氮钠、0.1%SDS、100μg/mlPMSF、1μg/ml抑肽酶、1%NP40、0.5%去氧胆酸钠),WesternBlot设备(Biorad),WesternBlot显色液(PierceBiotechnology),密度扫描分析(GeneTools分析软件),流式细胞仪(Becton-Dickinson);其余试剂为国产分析纯试剂。二、实验方法1.培养和代代相传293细胞按本实验室方法培养和传代,牛主动脉内皮细胞按本实验室建立的方法进行培养和传代,实验采用第2~5代细胞。2.raav病毒载体的纯化及鉴定采用腺相关病毒介导的表氧化酶转染内皮细胞,将表氧化酶cDNAs克隆至rAAV载体pXXUF1的巨细胞病毒启动子下游,按本实验室方法将rAAV-F87V、rAAV-2C11OR、rAAV-2J2、rAAV-GFP以钙磷转染法在293细胞中包装纯化,斑点杂交法测定病毒滴度。3.baec细胞的免疫印迹检测EET刺激:使用EET(5×10-5mol/L)、表氧化酶抑制剂17-ODYA(1×10-4mol/L)和(或)eNOS抑制剂L-NMMA(1×10-4mol/L)刺激BAEC细胞15min后,提取蛋白行免疫印迹检测磷酸化ERK、PI3K和磷酸化EGFR的蛋白表达水平。病毒转染:使用rAAV-F87V、rAAV-2C11OR、rAAV-2J2和rAAV-GFP(50病毒颗粒/细胞)转染BAEC细胞5天后细胞传代,细胞再培养48h后行免疫印迹检测表氧化酶的蛋白表达。免疫印迹:细胞处理后吸出培养基,用预冷磷酸盐缓冲液(phosphate-bufferedsaline,PBS)洗涤后加入三去污剂细胞裂解液,冰浴20min后用刮下细胞转至微量离心管,12000r/min×3min×4℃离心,转移上清液至新离心管。Bradford方法测定蛋白质浓度,等量蛋白质(10μg/孔)加入6×加样缓冲液,煮沸3min后上样,SDS聚丙烯酰胺凝胶(分离胶8%,积层胶4.5%)垂直电泳分离,电转至PVDF膜上(4℃转膜过夜),室温下含5%脱脂奶粉的TBS-T(10mmol/LTris·Cl+100mmol/LNaCl+0.1%Tween20)封闭2h,加入一抗(1∶500稀释)4℃作用过夜,第2天TBS-T于室温下洗膜4次,每次15min,加入辣根过氧化物酶偶联的二抗(1∶8000稀释),室温下轻摇2h,TBS-T室温下同法洗膜4次,增强的化学发光试剂显色曝光。4.甲基亚分光光度a经药物处理的细胞,按培养基体积的1/10加入MTT储存液(浓度为5g/L,PBS配制),继续培养4h后,吸弃培养液,加入二甲基亚砜(96孔板加入100μl,24孔板加入300μl)置室温30min,补加900μl二甲基亚砜并混匀后在分光光度仪上测定570nm处A值(OD值)。5.mtt检测细胞增殖外源性EET刺激取对数生长期细胞,用含100ml/L胎牛血清(胎牛血清)的DMEM培养基调整细胞浓度为2×107/L,以每孔0.2ml分别加入96孔的Nunc培养板内,置37℃、50ml/LCO2培养箱内培养12h,换0.5%胎牛血清的DMEM培养基饥饿培养12h,在氩气条件下分别加入不同种类及浓度的EET,血管内皮细胞生长因子(VEGF,10-3μg/L)为阳性对照,每剂量组设3复孔,为防止EET氧化,12h后换用新的培养基和同样浓度的EET,24h后行MTT检测细胞增殖。表氧化酶病毒感染:BAEC置75cm2培养瓶生长至80%汇合后,细胞计数后按1∶4传入6孔板,分别加入病毒(500p.f.u/个细胞),同时设空白对照和荧光蛋白病毒对照,每组重复3次,5天后以0.05%的胰酶(含0.02%的EDTA)完全消化细胞,1000g×3min×4℃离心收集细胞沉淀,等体积10%胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞,细胞计数后按1∶4传代,约6h细胞贴壁后换用含2%胎牛血清的DMEM培养基,48h后行MTT检测细胞增殖差异。6.流式细胞术检测外源性EET干预:BAEC置75cm2培养瓶生长至80%汇合后,细胞计数后按1∶3传代至6孔板培养12h,换0.5%胎牛血清的DMEM培养基饥饿培养12h,换用无血清的DMEM培养基,分别加入不同种类和不同浓度的EET孵育12h,行流式细胞仪检测,每组重复3次。表氧化酶病毒感染:按上文表氧化酶病毒感染中的方法加入病毒并培养5天后传代,约6h细胞贴壁后换用含0.5%胎牛血清的DMEM培养基,再12h后行流式细胞仪检测。流式细胞仪检测:细胞用胰酶消化,1000g×3min×4℃离心收集细胞沉淀,PBS洗一次,1000g×20s离心,取细胞沉淀加入75%酒精固定30min,1000g×3min×4℃离心收集细胞,PBS洗一次,加入10μlRNA酶(10mg/L)置37℃消化30min,离心收集细胞,加入0.5ml碘化吡啶(0.1g/L),调整细胞密度为1×109/L,4℃避光染色30min,上样行流式细胞仪检测(激发光波长488nm)。7.移行细胞数的检测利用改良的Boyden趋化小室进行细胞迁移趋化实验,使用8μm微孔多聚碳酸酯滤膜。BAEC细胞用DMEM培养液洗涤后调整为1×108/L,在趋化小室的下层加入200μl不含FBS的DMEM培养基及EET(1×10-7mol/L)作为趋化因子,然后盖上多聚碳酸酯滤膜,在趋化小室的上层加入细胞悬液800μl,在5%CO2和37℃条件下培养24h后拆卸装置,收取滤膜。擦净滤膜上层面的细胞,滤膜及下层细胞用甲醇固定,苏木素染色,200倍显微镜下照相,每张膜随机选择10个视野计算每高倍镜视野(HPF)中的移行细胞数。为5×108/L,每孔加入100μl细胞悬液,继续培养36h,并在显微镜下照相,选取6个视野,使用ScionImage软件计算类微血管结构的区域面积。8.小鼠血清中微血管的检测将Matrigel置冰浴中6h融解,以预冷的灭菌枪头取250μl铺24孔板,置冰浴6h使液面平整并消除气泡,置37℃30min使胶凝固。外源性EET:取BVEC细胞,0.05%的胰酶消化后用1%胎牛血清的DMEM培养基调整细胞为5×108/ml,每孔加入100μl细胞悬液,并分别加入对照溶媒和不同种类的EET,继续培养36h,在显微镜下照相,选取6个视野,使用ScionImage软件计算类微血管结构的区域面积。病毒感染:表氧化酶病毒感染5天后的牛主动脉内皮细胞用0.05%的胰酶(含0.02%的EDTA)消化,含0.5%胎牛血清的DMEM培养基调整细胞为5×108/L,每孔加入100μl细胞悬液,继续培养36h,并在显微镜下照相,选取6个视野,使用ScionImage软件计算类微血管结构的区域面积。9.计数三种血管分离培养取第6天鸡胚,消毒大头端,灭菌砂轮钻孔(1.5cm2×1.5cm2),去除壳膜,暴露尿囊腔,同时取大小一致的消毒滤膜(2mm2×2mm2),分别给予5μl等浓度的病毒(含5×109个病毒颗粒)并植入尿囊腔,消毒透明胶封口,每组6个,置37℃相对湿度为70%环境培养,每8h转动鸡胚1次以防胚膜粘连,培养至第15天,去除透明胶,以滤膜附着点为中心直径5cm范围剪下尿囊腔,10%甲醇漂洗固定并照相,以滤膜为中心选取等面积计数分支血管。10.细胞增殖及类微血管结构形成抑制剂为研究EET促进细胞增殖、细胞移行、细胞趋化、类微血管结构生成的信号转导机制,在给予细胞EET刺激时或表氧化酶病毒感染的同时给予MAPK抑制剂(apigenin,25μmol/L),或PKC抑制剂(H7,12μmol/L),或PI3K抑制剂(LY294002,15μmol/L),MEK抑制剂(PD98059,20μmol/L),其后按上述方法检测细胞增殖、细胞移行、细胞趋化、类微血管结构生成。另外为研究EET对信号转导分子的影响,我们在给予EET刺激1h后,按上法提取蛋白行免疫印迹直接检测磷酸化ERK、PI3K和磷酸化EGFR的蛋白表达水平。11.免疫组化检测血管生成情况30只雄性正常血压Wistar大鼠随机分为5组,戊巴比妥(50mg/kg)腹腔麻醉后,消毒铺巾,使用3-0丝线结扎右侧股动脉,从髂动脉分支游离至腘动脉处,术后1周检查下肢切口愈合情况良好,分别给予rAAV-2J2、rAAV-F87V、rAAV-2C11OR和rAAV-GFP溶于200μl无菌生理盐水,在内收肌附近多点注射(含大约3×1011virons),注射表氧化酶病毒后6周麻醉处死动物,取后肢骨骼肌,4%多聚甲醛固定,取肌纤维横面方向向上石蜡包埋,使用抗CD-31(plateletendothelialcelladhesionmolecule)行免疫组织化学染色,显微镜下(×400倍)ACT-1软件随机选择20个视野计数,计算毛细血管数目(mm2)、肌纤维数目(mm2)、毛细血管与肌纤维之比(肌纤维数目用以矫正可能的肌肉脱水和变形改变),评价血管生成情况。三、统计处理各参数之间的差异显著性应用统计软件SPSS11.0进行TwoWay-ANOVA检验,以均数±标准误表示。结果1.表氧化酶抑制剂的作用分别以不同种类和不同浓度的EET(8,9-,11,12-和14,15-EET)、一氧化氮合酶抑制剂L-NMMA和(或)表氧化酶抑制剂17-ODYA作用于BAEC细胞24h后行MTT检测,与对照组和溶媒组(乙醇)相比,三种EET(50nmol/L)均能显著促进内皮细胞的增殖,加用表氧化酶抑制剂17-ODYA可以显著抑制内皮细胞的增殖,而L-NMMA(100μmol/L)可部分逆转该作用(图1A)(P<0.01),更高浓度的L-NMMA作用结果类似,另外给予不同剂量的EET刺激显示它们的作用呈现剂量依赖性,其中14,15-EET作用相对较强而8,9-EET相对较弱(图1B),细胞计数也显示相似的结果。rAAV介导的三种表氧化酶转染BAEC7~8天后行免疫印迹,显示转染表氧化酶后相应的CYP102F87V,CYP2C11和CYP2J2均有效表达(图1C),MTT检测证实表氧化酶的过度表达能显著促进BAEC的增殖(P<0.01)(图1D)。2.中性细胞间增殖cyp-mas,ra教学-et的表达rAAV-2J2、rAAV-2C11、rAAV-F87V和rAAV-GFP分别转染一周或EET刺激12h后,收获细胞行流式细胞仪检测。结果显示,rAAV-2J2、rAAV-2C11和rAAV-F87V显著升高S+G2/M期的细胞比例,分别为(45.7±2.7)%,(49.1±3.4)%和(46.4±3.4)%,而对照组和GFP组分别为(26.8±2.5)%和(25.4±2.1)%(P<0.01)(图2A),EET刺激也显示类似的结果,14,15-EET的作用较其他两种略强(图2B),说明CYP表氧化酶可促进细胞进入分裂期而促进牛主动脉内皮细胞增殖。3.t刺激对内皮细胞趋化的影响我们使用改进的Boyden趋化小室研究EET刺激对内皮细胞趋化的影响。结果显示,EET显著促进BAEC的趋化(P<0.05)(图3A),并且呈现剂量依赖性(图3B)。4.图2不同的EET刺激24h后均能显著促进类微血管结构的形成(P<0.05)(图4A);表氧化酶基因病毒过度表达均能显著促进类微血管结构的形成,而单独加入表氧化酶抑制剂17-ODYA可抑制类微血管结构的形成(P<0.05)(图4B),进一步证实CYP表氧化酶具有促进血管形成的作用。5.对血管内皮功能的影响ERK抑制剂apigenin、MEK抑制剂PD89059、PI3K抑制剂LY294002显著抑制了EET对内皮细胞增殖的促进作用(P<0.01),而PKC抑制剂H7无明显作用(图5A、5B);信号转导抑制剂在EET促进趋化、移行和类微血管结构生成的实验中也表现出类似的效应。为进一步证实本研究的发现,在给予EET刺激后行免疫印迹分别检测EET对PI3K、磷酸化ERK影响,结果显示EET可显著上调PI3K、磷酸化ERK的蛋白表达(图5C、5D),另外还发现可显著上调磷酸化EGFR的蛋白表达(图5E)。由于既往我们证明EET可以显著上调eNOS的表达并促进NO的生成,为了进一步研究在内皮细胞中NO对EET信号转导的影响,我们给予EET刺激内皮细胞时,先给予eNOS抑制剂L-NMMA阻断NO的合成,行免疫印迹分别观察它们对磷酸化ERK和PI3K蛋白表达的影响,结果显示加用eNOS抑制剂L-NMMA则可以显著逆转EET对内皮细胞PI3激酶蛋白表达的促进作用,而不能逆转EET对内皮细胞磷酸化ERK蛋白表达的促进作用(图5F、5G)。6.raav-gfp对raac溶血性早发大鼠血管内皮数目的影响在鸡胚尿囊绒毛膜上给予腺相关病毒介导的表氧化酶(CYPF87V、CYP2C11OR和CYP2J2)转染15天后,分别计数一级和二级毛细血管数目,一级毛细血管数目在对照组为4.6±0.6,rAAV-GFP组为4.3±0.6,而在rAAV-F87V、rAAV-2C11OR和rAAV-2J2分别为13.1±0.9、8.9±0.7和7.0±0.5。二级毛细血管数目的计数结果在对照组为5.1±0.7,rAAV-GFP组为6.3±0.8,而在rAAV-F87V、rAAV-2C11OR和rAAV-2J2分别为13.9±1.4、11.1±1.2和10.3±0.9。7.表氧化酶转染组血清细胞系数动数大鼠缺血后肢给予表氧化酶转染6周后,取材转染局部的骨骼肌并使用CD-31行免疫组化染色,显微照相后使用ACT-1软件计数毛细血管数,结果显示与对照组相比,表氧化酶转染组毛细血管密度显著增加了30%~70%,其中在rAAV-CYP102F87V、rAAV-CYP2C11-CYPOR和rAAV-CYP2J2分别为(1260±62)/mm2、(1096±53)/mm2和(905±43)/mm2,而使用rAAV-GFP转染组仅为(706±24)/mm2(P<0.01)。eet促进血管生成的作用内皮细胞在心血管系统的短期和长期调节中均起着重要的作用,近年来作为内皮细胞花生四烯酸的第三条代谢通路,EET或表氧化酶对内皮细胞影响的研究日益受到重视,但到目前为止它们对内皮细胞和血管生成的影响尚缺乏较详细和深入的研究。血管生成是一个复杂的病理生理过程,为此我们分别从细胞增殖、细胞趋化、细胞迁移、细胞周期、类微血管结构形成和体内的毛细血管生成6个方面较为详尽的研究了EET对内皮细胞和血管生成的影响。在本项研究中,首先使用重组腺相关病毒介导的表氧化酶转染BAEC细胞1周后,免疫印迹检测显示与对照组相比,表氧化酶转染组有高效表达,可被用以从细胞内干预探讨EET对血管生成的影响。为研究CYP表氧化酶代谢产物对血管生成的影响,在BAEC中直接给予外源性EET刺激后行MTT检测。结果显示,各种EET均显著促进BAEC的细胞增殖,并且呈剂量依赖效应;3种表氧化酶病毒转染BAEC后行MTT检测,结果也证实了均可以显著促进内皮细胞的增殖;在给予EET刺激或CYP表氧化酶转染BAEC后,行流式细胞仪检测显示与对照组细胞相比,EET刺激后S+G2/M期的细胞比例显著增加,同样表氧化酶病毒转染BAEC后流式细胞仪检测也获得类似的结果,提示EET刺激或转染CYP表氧化酶可以促进BAEC进入分裂期而促进增殖。血管内皮细胞向受损的组织趋化、迁移是血管修补或新生血管的起始环节,为此,Boyden小室趋化实验和划痕修复实验被用以检测EET对BAEC趋化和迁移的影响,从而评价其促进血管生成的能力。研究结果显示各种EET均能呈剂量依赖性促进Boyden小室中内皮细胞的趋化,同样3种EET也显著促进BAEC的划痕修复并呈剂量依赖性,而3种表氧化酶病毒转染后都显著促进BAEC的划痕修复,进一步说明EET不但可以促进内皮细胞的移行,而且能定向趋化内皮细胞向受损组织迁移,促进血管的生成。内皮细胞的管腔化是血管形成的至关重要的环节,对内皮细胞形成管腔化能力的评估包括体外和在体两个方面。BAEC种于Matrigel上并加入EET,观察它们对类微血管结构形成的影响,结果发现不同的EET刺激24h后均能显著促进类微血管结构的形成;表氧化酶基因病毒转染5天后BAEC细胞种在Matrigel上结果均能显著促进类微血管结构的形成,这些实验从体外证实了EET可以促进内皮细胞的管腔化。利用CAM进行的在体研究显示,CYP表氧化酶过度表达明显促进毛细血管的形成,在基因转染组毛细血管分支的数目是对照组的2~3倍。上述结果都是基于一定生理条件的研究,在体内病理状态下的研究结果显示,大鼠缺血后肢给予表氧化酶转染6周后,与对照组相比表氧化酶转染组毛细血管密度显著增加,其增加幅度达到30%~70%,进一步证实表氧化酶代谢产物EET可以显著促进血管的生成。在EET促进血管生成信号转导机制的研究中,在细胞增殖、细胞趋化、划痕修复以及类微血管样结构形成中MAPK和PI3K均显著介导了EET的促进效应;同时蛋白水平的研究也证实了EET直接刺激或转染三种表氧化酶基因均可以显著上调MAPK和PI3K的蛋白表达。既往研究显示,在牛主动脉内皮细胞CYP表氧化酶的过度表达可以在mRNA和蛋白水平上调eNOS的表达,并促进eNOS的1179位丝氨酸的磷酸化。众所周知NO具有促进内皮细胞增殖、迁移和毛细血管结构形成的作用,并证实NO介导了血管内皮细胞生长因子促进血管生成的作用,Kawasaki等研究进一步证明NO的促血管生成作用是由PI3K/AKT途径介导的。基于上述研究发现,为进一步研究NO是否也介导了EET促进血管生成的效应,在上述实验中EET刺激的同时给予eNOS抑制剂L-NMMA,结果显示eNOS抑制剂仅能部分逆转EET对细胞增殖、划痕修复、细胞趋化和类微血管结构的形成。另外在蛋白水平的研究也显示eNOS抑制剂可以显著逆转EET对PI3激酶表达的影响,提示NO参与了EET对PI3K的激活,这些结果与Kawasaki等关于NO的促血管生成作用是由PI3K/AKT途径介