分子生物学实验基础4h

分子诊断学

罗建新第一章序论

第一节概述分子诊断学的形成在分子生物学及生物化学基础上发展起来的，以研究核酸和蛋白质结构、功能等生命本质的学科，在核酸、蛋白质分子水平研究疾病的发病、诊断、治疗和预后的机制。其中基因工程是目前分子生物学研究的热点之一，这些技术可以改造或扩增基因和基因产物，使微量的研究对象达到分析水平，是研究基因表达和调控的方法，也是在分子水平研究疾病发生机制、基因诊断和基因治疗的方法。

主要内容1.内源基因异常的检验和诊断自身基因结构异常基因功能异常表达产物蛋白质结构功能异常致病基因调控异常致病如肿瘤遗传病2.外源基因侵入体内检测及诊断病原微生物B,V依核心部分基因DNA,RNA不同检测及病原学分类如HBVHIV等核酸是生命的存在形式蛋白质是生命表现形式3.分子诊断学与以往医学诊断的关系DNARNA临床表现蛋白质转录逆转录翻译基因诊断生化检验临床诊断HGP完成第二节分子生物学实验基础

一、基本概念核酸（ＤＮＡＲＮＡ）结构理化性质复性变性Tm值蛋白质结构理化性质

基因重组(Geneticrecombination)基因重组是自然界常见到现象，指的是整段DNA在细胞内或细胞间、甚至在不同物种之间进行交换，并能在新的位置上复制、转录和翻译。它在进化、繁殖、病毒感染、基因表达以及癌基因激活等过程中起着重要作用。也可以认为是一种自然突变现象。

基因重组的方式转化(Transformation)

外来基因引起细胞生物性状改变的过程或将质粒或以质粒为载体的重组DNA分子导入受体细胞的过程。

转染（Transfection）

以噬菌体或病毒或以之为载体所构建的重组DNA分子导入宿主细胞的过程。

转导（Transduction）

利用载体把遗传物质从一种宿主传给另一宿主的过程。转位（Transposition）

一个或一组基因从一处转移到基因组的另一位置的过程，这些游动的基因称为转位子(Transposon)。

遗传工程广义:整体水平细胞水平染色体水平分子水平狭义:指分子水平基因工程基因克隆DNA克隆重组DNA技术相关概念

DNA克隆

克隆（clone）：

来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。

克隆化（cloning）：

获取同一拷贝的过程，即无性繁殖。 分子克隆（DNA克隆） 细胞克隆 个体克隆（动物或植物）基因工程（Geneengineering）

定义

指在体外将外源核酸分子插入质粒、病毒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，并使之参入到原先没有这类分子的寄主细胞内，并且能持续稳定地繁殖。基因克隆（Genecloning）体外重组DNA技术（invitrorecombinantDNAtechnology）DNA克隆：应用酶学的方法，在体外将各种来源的

DNA与载体DNA结合成具有自我复制能力的

DNA分子，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子。又称基因克隆或重组DNA。1972年P.Bergetc首次用EcoRI切.接

SV40和λphageDNA构建第一个人工DNA分子.获1981年诺贝尔化学奖1973年Cohens.etc用EcoRI切.体外连接质粒Tc-pSC101和Neo-R6-5导入大肠杆菌,使其具有四环素和新酶素抗性.完成第一分子克隆全过程.

重组DNA技术基本原理

分离纯化或人工合成带有目的基因的DNA片段；在体外将目的基因与载体DNA结合，成为重组DNA分子；将重组DNA导入到适当的受体细胞，并与之一起增殖；同时筛选出带有重组DNA分子的受体细胞克隆；从筛选出来的受体细胞克隆中，提取目的基因供进一步分析研究使用；将目的基因克隆到表达载体并导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下，实现功能表达。二、基因工程的常用工具1.定义指能把外源DNA（目的基因）导入宿主细胞，并使之传代、扩增、表达的工具。

（一）载体（Vector）能够独立自主的复制，且目的基因的插入不影响载体的复制能力；具有至少一个单一酶切位点；

具有显著的遗传标记，便于筛选；

供插入外源基因的片段范围大，且能稳定存在；

载体本身分子量小，拷贝量高；安全。

2.条件按来源分质粒（plasmid）

噬菌体（phage）

病毒（virus）3.分类按用途分克隆载体表达载体4、质粒(1)定义是一种存在于细菌中，独立于细菌染色体之外的遗传因子，能够自主稳定独立复制的共价闭环的双链DNA，一般对细菌的生存无影响。

(2)分类：根据拷贝数可将质粒分成两种不同的复制型

“严紧型”质粒（stringentplasmid）

“松弛型”质粒（relaxedplasmid）(3)命名

eg：pBR322“P”------表示是一种质粒plasmid“BR”----分别取自该质粒的两位主要构建者

F.Bolivar和R.L.Rodriguez姓氏的第一个字母322------指实验编号，以与其它质粒载体如：

PBR325、PBR327等相区别(4)举例

pBV220优点：1.

个体较小（几个kb），易于获得；2.

含有显著的遗传标记通常有2个以上；3.

拷贝数高；4.

易于导入外源基因，易于进入宿主细胞并稳定存在；

缺点：可插入的外源片段小10kb以下。特点5、噬菌体载体λ噬菌体及其衍生物单链噬菌体M13

粘尾质粒（cosmid）等猴多瘤病毒40（SV40）

腺病毒

逆转录病毒等

6、病毒载体.噬菌体（phage）DNA

λ噬菌体DNA改造系统

λgt系列（插入型，适用cDNA克隆）

EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）

M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因）

M13mp系列

pUC系列柯斯质粒（cosmid）

酵母人工染色体载体 （yeastartificialchromosome,YAC）

细菌人工染色体 （bacterialartificialchromosome,BAC）

动物病毒DNA改造的载体 （如腺病毒、腺病毒相关病毒、逆转录 病毒）（二）工具酶基因的分离和重组，涉及到一系列相互关联的酶促反应，已知道有许多重要的核酸酶（如限制性核酸内切酶、连接酶、聚合酶、末端转移酶等等）在基因克隆实验中有着广泛的用途。而其中限制性核酸内切酶和连接酶的发现和应用，才真正使DNA分子的体外切割与连接成为可能，是DNA重组技术赖以创立的重要酶学基础。1、限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）

定义是一类能识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。常形象地称之为核酸分子的“手术刀”。命名

eg：EcoRI、HindⅢ分型

识别DNA的特异序列，并在识别位 点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。 是细菌内存在的保护性酶。分为I、II、III三类。II类酶识别序列特点为回文结构。

······GGATCC······ ······CCTAGG······特性Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型限制和修饰活性同时具有内切酶、核酸内切酶类似I，多功能酶甲基化酶活性

酶的蛋白结构3种不同的亚基单一的成分2种不同的亚基

所需的辅助因子

ATP、Mg2＋、Mg2＋ATP、Mg2＋、S-腺苷甲硫氨酸S-腺苷甲硫氨酸切割位点在距特异性位点至少位于特异性位点距特异性位点3’端

1000bp的地方可能随或其附近24～26bp处机地切割序列特异的切割否是是在DNA克隆中的无用十分有用用处不大用处

核酸内切限制酶的类型及其主要特性

活性单位

在一定的反应条件下（pH、温度、离子浓度等）和时间内(60分钟)能够完全酶解1μg的DNA分子底物所需的酶量

识别、切割序列

能识别由4～8个核苷酸组成的特定的核苷酸序列（称为核酸内切限制酶的识别序列）两条链上的断裂位置是交错的、但又是对称地围绕着一个对称轴排列，形成所谓粘性末端DNA片段

EcoRI↓

5’－G┆AATTC－3’5’－GAATTC－3’

3’－CTTAA┆G－5’3’－CTTAAG－5’

↑PstI↓

5’－CTGCA┆G－3’5’－CTGCA

G－3’

3’－G┆ACGTC－5’

3’－G

ACGTC－5’

↑断裂类型两条链的断裂位置是处在一个对称结构的中心，形成平末端的DNA片段。

HaeⅢ

↓

5’－G-G－C-C－3’

5’－G-G

－3’

5’－

C-C－3’

3’－C-C－G-G－5’

3’－C-C

－3’

5’－

G-G－5’

↑

5´-端突出

粘性末端

3´-端突出

限制性核酸内切酶识别序列长度为4~8个bp。

不同酶切产生的相同粘性末端称配伍末端（compatibleend），可用连接酶连接。

限制性核酸内切酶作用后产生两种末端：

钝性末端(bluntend)粘性末端(stickyend)星号活力（staractivity）

在一些非标准反应条件下，限制性核酸内切酶能够识别和切割与其特异性识别序列相类似的序列，使切割的特异性下降。

导致星号活力的产生因素高浓度的限制性核