第九章 酶分子的定向进化

第八章酶分子的定向进化广州大学生命科学学院柯德森第一节酶分子定向进化简介一.概念:分子定向进化：在实验室试管中模拟达尔文的自然进化原理，对蛋白质(酶)的基因利用随机突变和随机杂交的方法加以改造，通过大规模筛选，从而得到性能上改良的优异变种。使蛋白质(酶)在自然界需要几百万年才能完成的进化过程缩短至几个月，为蛋白质(酶)的工程应用提供了一个强有力的技术手段。属于蛋白质的非合理设计,它不需要事先了解酶的空间结构和催化机制,人为地创造特殊的进化条件,模拟自然进化机制(随机突变,基因重组和自然选择),在体外改造酶,并定向选择(筛选)出所需要性质的突变酶.可以促使群体生物大分子向任意功能目标进化，从而获得或改良功能大分子。可以在几星期或几个月增强基因或蛋白质的某种特性，将可用于制造副作用更小的新药物、营养价值高的作物品种，或更有益于环境的化学加工等等。一.基本原理:合理设计与非合理设计:在比较充分了解酶的结构和功能的基础上对酶分子进行改造,称为合理设计;不需要准确的酶分子结构信息,通过随机突变,基因重组,定向筛选等方法对其进行改造,称为酶分子的非合理设计.非合理设计实用性较强,往往可以通过随机产生的突变改进酶的特性.其基本技术手段:易错PCR,DNA重组,高突变菌株等技术.达尔文进化所有自然界存在的酶均是基于自然选择的达尔文进化的产物。受自然界中成就的启发，科学家们开始掌握和应用这一进化理论，在实验室中完成达尔文进化，这不仅包括生物机体与细胞水平，还包括在单个的生物大分子水平上。达尔文进化主要包括重复进行的三个过程：选择、扩增和变异

选择，不管是自然的或人工的，均是一个从“不富有者(thehave-nots)”群体中分离“富有者(thehavesorthefecund)”的扬弃过程。在实验室中，富有者则是那些能满足实验人员所附标准要求的分子。扩增，就是产生子代；更确切地说，就是备份遗传基因。在实验室中，实验人员将选择与扩增关联，仅使那些能满足所附标准要求者产生子代。确切地说，不是所选分子本身，而是它们的基因被扩增。变异，就是引入变种。定向分子进化的功效在于巨大数量的力量和分子多样性。二、天然酶分子虽然已经进化了千百万年,但仍然蕴藏着具大的发展空间:天然酶在生物体内存在环境与酶的实际应用环境不同.因此提供了在实际环境中的巨大的进化空间;自然的选择压力是酶分子与各种生物分子之间协调作用,以适应周围环境的需要,而实际应用中总是希望该酶活力和稳定性越高越好.自然的选择压力更多地是体现在更好地调节能力,而不是活性和稳定性的提高;当人为创造需要高活力和高稳定性的选择压力时,就可能使酶向相应的目标进化;第二节定向进化的策略易错PCR:使用Taq酶进行PCR扩增目的基因时,通过调整反应条件,例如提高Mg2+浓度,加入Mn2+,改变体系中四种dNTP的浓度等,改变Taq酶的突变频率,从而向目的基因中,以一定的频率随机引入突变构建突变库然后选择或筛选需要的突变体.连续易错PCR:即将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下一次PCR扩增的模板,连续反复地进行随机诱变,使每一次获得的小突变积累而产生重要的有益的突变.第二节定向进化的策略DNA改组技术:是一种有性PCR,将已经获得的存在于不同基因中的正突变结合在一起组成新的突变基因库.其基本的操作过程是从正突变基因库中分离出来的DNA片段用脱氧核糖核酸酶I随机切割,得到的随机片段经过不加引物的多次PCR循环,随机引物片段之间互为模板和引物,直到获得全长的基因,这导致来自不同基因片段之间的重组.该策略将来自亲本基因中的优势突变尽可能地组合在一起,在理论上优于连续的易错PCR等无性进化的策略.定向进化的选择策略:筛选的方法必须灵敏,至少与目的性质相关;筛选的方法必须有明显的可供测量的信号;选择的标准必须是合乎研究目的的指标突变体的构建及应用(一)构建理想基因文库要考虑的因素:1.基因文库的质量:文库的代表性和突变基因片段的完整性文库的代表性:指文库包含的DNA分子是否能完整地反映出来源基因的全部可能的变化和改变,是体现文库质量的最重要指标;突变基因的完整性:突变DNA片段应尽可能地完整反映出基因的结构.(二)构建突变文库的载体系统:优缺点1.噬菌体载体系统:优点为可以装载容量大的,适合于大片段的克隆.较好的质量控制;缺点:可采用的文库筛选方法有限,常常在载体系统中无法表达.2.质粒载体系统:操作方便,可塑性强,能够实现对基因文库的功能筛选.缺点:插入片段的容量较小.(二)构建突变文库的载体系统:优缺点3.哺乳动物细胞表达系统:是一个新动向,已显示了良好的前景.文库的筛选策略:两种基本策略:根据已知基因编码产物的特定活性进行筛选.这种方法可以很直观快速地检出有效突变的基因.但需要有比较直观和明显的生物学检定形状的出现.不需要附加任何条件,通过检测在特定条件下来源于两个文库的基因编码产物之间发生相互作用的情况,从而确定这两个文库中的所有可能在生理上发生相互作用的基因对,描绘出某一特定类型细胞内表达出基因之间发生的基因相互作用联络图.2.筛选方法:基于基因编码蛋白质的检测筛选表达文库:前提条件是文库中的基因必须在宿主细胞中获得功能性表达.嗜菌体表面展示系统:是通过体外富集策略进行基因文库筛选的一种具体方法;酵母双杂交系统酵母单杂交系统:酵母双杂交系统双杂交系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。80年代的工作表明,转录激活因子在结构上是组件式的(modular),即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成,其中有DNA结合结构域(DNAbindingdomain,简称为DB)和转录激活结构域(activationdomain,简称为AD),它们是转录激活因子发挥功能所必需的。单独的DB虽然能和启动子结合,但是不能激活转录。而不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。如酵母细胞的Gal4蛋白的DB与大肠杆菌的一个酸性激活结构域B42融合得到的杂合蛋白仍然可结合到Gal4结合位点并激活转录。

Fields等人的工作标志双杂交系统的正式建立。他们以与调控SUC2基因有关的两个蛋白质Snf1和Snf2为模型,将前者与Gal4的DB结构域融合,另外一个与Gal4的AD结构域的酸性区域融合。由DB和AD形成的融合蛋白现在一般分别称之为“诱饵”(bait)和“猎物”或靶蛋白(preyortargetprotein)。如果在Snf1和Snf2之间存在相互作用,那么分别位于这两个融合蛋白上的DB和AD就能重新形成有活性的转录激活因子,从而激活相应基因的转录与表达。这个被激活的、能显示“诱饵”和“猎物”相互作用的基因称之为报道基因(reportergene)。通过对报道基因表达产物的检测,反过来可判别作为“诱饵”和“猎物”的两个蛋白质之间是否存在相互作用。在此Fields等人采用编码β-半乳糖苷酶的LacZ作为报道基因,并且在该基因的上游调控区引入受Gal4蛋白调控的GAL1序列。这个改造过的LacZ基因被整合到酵母染色体URA3位上。而酵母的GAL4基因和GAL80基因(Gal80是Gal4的负调控因子)被缺失,从而排除了细胞内源调控因子的影响。已经知道在Snf1和Snf2之间存在相互作用。结果发现只有同时转化了Snf1和Snf2融合表达载体的酵母细胞才有β-半乳糖苷酶活性,单独转化其中任何一个载体都不能检测出β-半乳糖苷酶活性。

目前发展起来的各种双杂交系统大多是以Fields等人建立的系统为基础的。这些新系统主要对报道基因、“诱饵”表达载体以及“猎物”表达载体等做了一些改进。其中一个重要改进是引入额外的报道基因,如广泛采用的HIS3基因。经过改造带有HIS3报道基因的酵母细胞,只有当HIS3被启动表达才能在缺乏组氨酸的选择性培养基上生长。HIS3报道基因的转录表达是由“诱饵”和“猎物”的相互作用所启动的。大多数双杂交系统往往同时使用两个甚至三个报道基因,其中之一是LacZ。这些改造后的基因在启动子区有相同的转录激活因子结合位点,因此可以被相同的转录激活因子(如上述的Gal4蛋白)激活。通过这种双重或多重选择既提高了检测灵敏度又减少了假阳性现象。其他还有针对“诱饵”或“猎物”表达载体等所作的改进,这里不一一详述。

在双杂交鉴定过程中要经过两次转化,这个工作量是相当大的,特别是寻找新的作用蛋白质的时候尤其如此。而且,酵母细胞的转化效率比细菌要低约4个数量级。因此转化步骤就成为双杂交技术的瓶颈。Bendixen等人通过酵母接合型的引用,避免了两次转化操作,同时又提高了双杂交的效率。在酵母的有性生殖过程中涉及到两种配合类型：a接合型和α接合型,这两种单倍体之间接合(mating)能形成二倍体,但a接合型细胞之间或α接合型细胞之间不能接合形成二倍体。根据酵母有性生殖的这一特点,他们将文库质粒转化α接合型酵母细胞,“诱饵”表达载体转化a接合型细胞。然后分别铺筛选平板使细胞长成菌苔(lawn),再将两种菌苔复印到同一个三重筛选平板上,原则上只有诱饵和靶蛋白发生了相互作用的二倍体细胞才能在此平板上生长。单倍体细胞或虽然是二倍体细胞但DB融合蛋白和AD融合蛋白不相互作用的都被淘汰。长出来的克隆进一步通过β-半乳糖苷酶活力进行鉴定。这项改进不仅简化了实验操作,而且也提高了双杂交的筛选效率。

在研究蛋白质的结构功能特点、作用方式过程中,有时还要通过突变、加抑制剂等手段破坏蛋白质间的相互作用。针对实际工作中的这种需要,Vidal等人发展了所谓的逆双杂交系统(reversetwo-hybridsystem)。这项技术的关键是报道基因URA3的引入。URA3基因在这里起到了反选择的作用,它编码的酶是尿嘧啶合成的关键酶。该酶能把5-氟乳清酸(5-FOA)转化成对细胞有毒的物质。Vidal等人通过改造在URA3基因的启动子内引入Gal4的结合位点。这个改造的酵母菌株在缺乏尿嘧啶的选择性培养基上只有当“诱饵”和“猎物”相互作用激活URA3基因的表达才能生长。在含有5-FOA的完全培养基上“诱饵”和“猎物”的相互作用则抑制细胞的生长。然而如果目的蛋白,即与DB或AD融合的蛋白质发生了突变或者由于外加药物的干扰不再相互作用,URA3基因不表达,则细胞能在含有5-FOA的完全培养基上生长。通过这种方法，Vidal等人筛选到了转录因子E2F1的突变物,这些突变物仍然能结合视网膜母细胞瘤蛋白RB,但是丧失了同另外一种称为DP1蛋白的结合能力。结果得到了体外结合实验的验证。通过对这些突变蛋白基因的测序,他们发现了新的E2F1同DP1结合的位点。酵母单杂交(yeastonehybrid)酵母单杂交(yeastonehybrid)技术是体外分析DNA与细胞内蛋白质相互作用的一种方法，通过对酵母细胞内报告基因表达状况的分析，来鉴别DNA结合位点并发现潜在的结合蛋白基因，或对DNA结合位点进行分析.运用此技术，能筛选到与DNA结合的蛋白质，并可直接从基因文库中得到编码该蛋白质的核苷酸序列，而无需复杂的蛋白质分离纯化操作，故在蛋白研究中，具有一定的优势；而且，酵母属真核细胞，通过酵母系统得到的结果比其他体外技术获得的结果更能体现真核细胞内基因表达调控的真实情况.

酵母单杂交技术的原理酵母单杂交技术最早是1993年由Lietal[1,2]从酵母双杂交技术发展而来，酵母双杂交技术通过对报告基因的表型进行检测以实现对蛋白质间相互作用的研究[3-6]，而酵母单杂交技术则通过对报告基因的表型检测，分析DNA、蛋白之间的相互作用，以研究真核细胞内的基因表达调控.

目前认为真核生物的转录起始需要转录因子的参与.这些转录因子通常由一个DNA特异性结合功能域和一个或多个与其他调控蛋白相互作用的激活功能域组成，即DNA结合结构域(DNA-bindingdomain,BD)和转录激活结构域(activationdomain,AD).用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白即是一种典型的转录因子.研究[2]表明GAL4的DNA结合结构域靠近羧基端,含有几个锌指结构,可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS);而转录激活结构域可与RNA聚合酶或转录因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性.在这一过程中，DNA结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用.据此，我们可将GAL4的DNA结合结构域置换为其他蛋白，只要他能与我们想要了解的目的基因相互作用，就照样可以通过其转录激活结构域激活RNA聚合酶，从而启动对下游报告基因的转录.正是基于这一理论，酵母单杂交系统由2部分组成：(1)将文库蛋白片段与GAL4转录激活域融合表达的cDNA文库质粒；(2)含有目的基因和下游报告基因的报告质粒.在实验中,首先将报告质粒整合入酵母基因组,产生带有目的基因的酵母报告株;再将文库质粒转化入报告株;若存在文库蛋白与目的基因的相互作用,可通过对报告基因的表达将文库蛋白的基因筛选出来.

酵母单杂交技术的应用酵母单杂交技术是建立在许多真核转录因子在结构和功能上是由独立的DNA结合结构域和DNA激活结构域组成的基础上，这使得研究者可以构建不同的基因融合体，在酵母中表达融合蛋白，以同时结合特异的目的基因和激活转录.理论上，在酵母单杂交技术中，任何目的基因都可捕获能与目标因子特异结合的蛋白[2].酵母单杂交技术应用归纳为以下二类:2.1鉴别DNA结合位点，并发现潜在的结合蛋白基因目前对于酵母单杂交技术的应用主要体现在这方面.Chewetal[7]应用酵母单杂交技术证实了在大鼠脑中存在的COUP-TFⅠ、EAR2和NURR1等蛋白质是GRIK5基因的内含子结合蛋白，从而进一步验证了多种核孤儿受体可通过与内含子序列结合发挥其调控神经递质受体基因作用的假设.Weietal[8]1999年运用此技术确定了特异性结合于海胆胚胎孵化酶(SpHE)基因调控区域的反式激活因子SpEst4.Siewekeetal[9]运用酵母单杂交技术对转录辅助因子进行了筛选.Huangetal[10]为分离与人ε-珠蛋白基因上游沉默子片段相互作用的蛋白，运用酵母单杂交技术，利用人肝cDNA文库进行筛选，得到能与其结合的蛋白RPL3(ribosomalproteinL3),并通过电泳迁移率变动实验(EMSA)和竞争抑制实验证实其确有结合该沉默子活性,进而说明RPL3通过与人ε-珠蛋白基因上游沉默子结合，在胚胎阶段的沉默人ε-珠蛋白基因表达中扮演了重要角色.Liaoetal[11]于2002年运用酵母单杂交技术筛选出了能与大鼠谷胱甘肽S-转移酶(GST)P增强子GPEⅠ核心序列相互作用的转录因子，经对2个阳性克隆pYGPE1和pYGPE2的鉴定发现pYGPE1的插入片段与大鼠原癌基因c-juncDNA具有99%同源性，其编码的氨基酸残基序列与大鼠c-jun蛋白具有100%同源性，pYGPE2的插入片段与大鼠线粒体腺苷酸转位酶cDNA具有99%同源性,其编码的氨基酸序列与大鼠腺苷酸转位酶具有100%同源性，并由此得出结论c-jun蛋白和线粒体腺苷酸转位酶可能是作用于GPEⅠ的反式激活因子.2.2对DNA结合结构域进行分析如果能得到DNA结合结构域的结构信息,就可以用酵母单杂交技术对该结构进行分析[2].早在1993年，就有人[12,13]用酵母单杂交技术对2个不同的锌指蛋白的DNA结合结构域进行了分析.Lisowskyetal[14]在1999年使用酵母单杂交技术，利用一个“GC”富集区序列筛选出一种新的具有转录激活活性的锌指蛋白，由于其结合的序列富含“GC”，故命名为GC-box结合蛋白.Maketal[15]运用此技术测试哺乳动物具有基本的螺旋-环-螺旋(bHLH)结构的转录因子,通过对肌调节因子4(MRF4)的研究，证实其具有转录活性，并进一步证明运用酵母单杂交技术能在哺乳动物cDNA文库中筛选出与E-boxDNA相互作用的新的bHLH蛋白.Nishiyamaetal[16]运用酵母单杂交技术并结合点突变方法对转录活性片段Elf-1进行分析，确定具有转录活性的区域位于第87-175碱基区.存在问题及解决办法3.1在鉴别DNA结合位点中存在的缺陷由于细胞技术的先天局限性,即影响因子多，因此，可能有内源性的酵母表达激活物与DNA结合位点结合,并激活报告基因的表达，则相应的目的基因片段可能因此而被漏检.这个问题在试图鉴定某基