第十九章 基因工程抗体与导向药物

第十九章

基因工程抗体与导向药物

一、抗体的基因结构和重排二、基因工程抗体的构建和类型三、基因工程抗体的表达四、导向药物五、基因工程抗体的导向生物治疗一、抗体的基因结构和重排（一）重链V区基因人类VH（119）-D（30）-J（9）（二）轻链基因的结构和重排如图19-2κ链：Vκ（100）、Jκ（5）、Cκ（1）λ链：Vλ（100）Jλ（6）Cλ（6）（三）重链C区基因如图19-3Cμ-Cδ-Cγ3-Cγ1-Cε2-Cα1-Cγ2-Cγ4-Cε-Cα2（四）人源性单抗的抗体组合文库技术（原理）1．mRNA的提取2．RT-PCR制备cDNA3．抗体组合文库技术4．噬菌体表面呈现技术（phagedisplaytechnology）5．阳性克隆的筛选二、基因工程抗体的构建和类型(一)嵌合抗体(ChimericAntibody)

(二)人源化抗体(Humanigedantibody)

(三)小分子抗体（四）人源性单抗的抗体组合文库技术（一）嵌合抗体鼠Ig的V区与人Ig的恒定区（C区）基因重组后，在原核细胞或真核细胞中表达，这种嵌合抗体含75～80%人抗体，20%鼠抗体,注入人体后可减少人抗鼠抗体的反应。其优点是减少了鼠单抗的免疫原性，另外人抗体C区仍可有效地发挥补体激活和与FC受体结合的生物学活性，在构建时可以有目的地选择抗体类型，可有效地发挥抗体的生物效应，已有多种针对不同抗原的嵌合抗体的报道、但多为IgG1亚类。（二）人源化抗体为了减少嵌合抗体中鼠源性序列，人们又将鼠抗体V区（H、L链）中的3个超变区基因插入人抗体的V区的框架（FR）基因中，这样构建的抗体保留了鼠抗体与抗原结合的特异性。这种抗体几乎百分之百人源化了。目前针对不同抗原如肿瘤相应抗原、细胞表面受体、细胞因子等，已构建了许多种人源化基因工程抗体。(三)小分子抗体

（1）单链抗体(SingleChainFvScFv)（2）重组Fab片断（3）单域结构VH或VL

（4）双特异性抗体（5）免疫粘连素（6）催化抗体单链抗体单链抗体(SingleChainFvScFv);它是由抗体重，轻链的可变区基因(VH、VL)之间通过一段编码连接肽基因，拼接后表达形成的重组蛋白。是一种具有抗原结合能力的最小抗体片段，可在一些不需Fc段效应功能的实际应用中开展研究和应用。其优点是分子量小，易于穿透组织到达靶器官发挥功效，易于构建和生产，但易于被清除。重组Fab片断重组Fab片断是单价的VH-CH（Fd）和轻链的VL-CL两个片断由二硫键连接而成。它具有与抗体相同的抗原结合活性，其特点是结构稳定，制作简便。细菌表达的Fab与酶解Ig后所获得的Fab具有相同的功能。单域结构VH或VL分别由单域VH或VL采用基因工程法构建的抗体组成，该类抗体构建简便，鉴于在抗原结合部位中，VH作用比VL大，大多数单独的VH保留了较好的抗原结合能力和专一性，单独VL抗体因只有一个功能区而没有抗原结合能力，无应用价值，因此单域VH抗体在制备和应上有其优点，然而由于暴露了原先与VL结合的疏水性，使其特异性降低，还需对VH片断做一些结构改造才能应用。双特异性抗体双特异性抗体：将两个抗体的重链和轻链V区基因的重组体导入宿主细胞中表达，或用肽链连接物连接两种不同特异性抗体的可变区基因，构建单肽双特异性抗体。如：将抗肿瘤细胞EGFR的Fab与抗T细胞CD3的Fab组成双特异性抗体，有助于介导T细胞杀肿瘤（连接效-靶细胞）（如图19-4）。抗纤维蛋白的ScFv-tPA基因连接，有助于与血栓中的纤维蛋白结合，使tPA定位溶解血栓，此外还可作为载体将毒素、核酸、药物、定位于靶细胞，发挥治疗肿瘤和心血管疾病。免疫粘连素抗体恒定区（C区）N-端基因连接人细胞受体（CD4-FC）或粘附分子基因在真核细胞中表达正确折叠的抗体样融合蛋白（称免疫粘连素），，N端为同一种分子称为同源二聚体结构。N端为两种不同的分子称异源二聚体结构。一方面可发挥抗体效应，另一方面N端CD4为T细胞亚类糖蛋白，又是HIV受体，CD4可与HIV结合由FC活性杀灭HIV，可阻断HIV感染T细胞。催化抗体基因工程催化抗体是通过在轻链V区插入能与金属离子结合的氨基酸序列，再与重链V区重组，使重链V区识别抗原，并选择性地结合底物，轻链则可通过促进底物反应过渡态的形成而发挥催化作用。

三、基因工程抗体的表达(一)在哺乳动物细胞（CHO）中的表达

(二)在微生物(原核)细胞中的表达

(三)在植物中表达（四）在酵母中表达

四、导向药物导向药物是由单抗与放射性核素(诊断用)、毒素或化学药物的偶合物，也可用破坏细胞结构的酶、细胞因子等连接，称为生物导弹，可特异地导向靶细胞的特定位点，发挥特意诊断和治疗作用。五、基因工程抗体的导向生物治疗单克隆抗体作为诊断试剂，应用已相当普遍。但单抗作为生物导弹的治疗剂，鼠源性单抗常会因过敏反应而妖折，自基因工程抗体问世后，成为最有前景的发展领域。常用于溶栓、杀肿瘤、抗病毒感染、杀死耐药菌的生物治疗。甚至可用抗HIV的ScFv基因来阻止HIV复制等。随着噬菌体表面呈现技术的发展，抗体组合文库技术的成熟和推广应用，单抗的生物导弹功效将会有效发挥，其临床应用前景较为广阔，市场是巨大的，必将会产生巨大的社会和经济效益。RT-PCR制备cDNA设计VH/VL或L链/Fd链基因上、下游引物进行RT-PCR抗体组合文库技术将PCR产物VH/VL或