第七章-双水相萃取和反胶团萃取

第七章双水相萃取技术和反胶团萃取

溶液的分相不一定完全依赖于有机溶剂，在一定条件下，水相也可以形成两相(即双水相系统)甚至多相。于是有可能将水溶性的酶、蛋白质等生物活性物质从一个水相转移到另一水相中，从而完成分离任务。有机溶剂萃取的不足：许多蛋白质都有极强的亲水性，不溶于有机溶剂；蛋白质在有机溶剂相中易变性失活。双水相系统某些高聚物之间或高聚物与无机盐之间在水中以适当的浓度溶解，形成互不相溶的两水相或多水相系统。双水相体系简介1896年Beijerinck观察到当把明胶与琼脂和可溶性淀粉的水溶液混合时先得到一个混不透明的溶液，随之分为两相，上相富含明胶，下相富含琼脂（或淀粉），这种现象被称之为聚合物的不相溶性，从而产生了双水相体系。分相时间短(特别是聚合物/盐系统),自然分相时间一般只有5～15min。目标产物的分配系数一般大于3,大多数情况下,目标产物有较高的收率。大量杂质能够与所有固体物质一起去掉,与其它常用固液分离方法相比,双水相萃取技术可省去1～2个分离步骤,使整个分离过程更经济。设备投资费用少,操作简单,不存在有机溶剂残留问题。双水相萃取技术的优点一、双水相分离理论1、双水相的形成熵增——混合——自发分子间作用力------随着Mr的增加而增大

聚合物的不相容性------含有聚合物分子的溶液发生分相的现象聚合物的不相溶性由于聚合物分子的空间阻碍作用，相互间无法渗透，当聚合物的浓度达到一定值时，就不能形成单一的水相，所以具有强烈的相分离倾向。某些聚合物的溶液与某些无机盐的溶液相混合时，只要浓度达到一定值，也会形成两相，即聚合物—盐双水相体系。常用聚合物：聚乙二醇－葡聚糖聚乙二醇－无机盐系统无毒原则2、相图双水相的形成和定量关系可用相图表示：临界点(criticalpoint)：当系线长度趋于零时,两相差别消失,任何溶质在两相中的分配系数均为1。如C点。杠杆原理：均相区两相区双节线系线聚合物的分子量越高，相分离所需的浓度越低两种聚合物的分子量相差越大，双节线的形状越不对称。3、物质在两相中的分配

和溶剂萃取法一样，物质在两水相中的分配用分配系数K表示。

CTK=——CBCt、CB——分别代表上相、下相中溶质的浓度

K—与温度、压力以及溶质和溶剂的性质有关，与溶质的浓度无关。1）表面自由能的影响(大分子物质表面性质对K影响很大)2）表面电荷的影响(盐效应：两相系统中如存在盐,对K影响较大)3）综合考虑（影响因素很多，单因素定量很困难，最佳操作条件靠实验）4）影响分配平衡的参数

(1)聚合物的影响；(2)体系中无机盐离子的影响；

(3)体系PH的影响；(4)体系温度的影响；

(5)体系中微生物的影响。1）表面自由能的影响2）表面电荷的影响道南电位(,Donnanpotential):实际双水相系统中有电解质,当这些离子在两相中K

1,则两相间产生电位差

U2，U1——相1和相2的电位

Z+,Z－——分别表示一种盐的正负离子的离子价

F——法拉第常数

T——温度进一步可证明：InKi*=InKi+

ZiF(U2-U1)RTKi*——i组分带电时在体系中的分配系数

Ki——i组分不带电时在体系中的分配系数

Zi——i组分的离子价意义：A

荷电溶质的分配系数的对数与溶质的净电荷数成正比.B由于同一双水相系统中添加不同的盐产生的

不同,故k与Zi的关系因盐而异。3）综合考虑4）影响分配平衡的因素(1)聚合物的影响聚合物相对分子量的影响

当聚合物的分子量降低时，蛋白质易分配于富含该聚合物的相。例如在PEG—DeX系统中，PEG的分子量减小，会使分配系数增大，而葡聚糖的分子量减小，会使分配系数降低。这是一条普遍的规律，不论何种成相聚合物系统都适用。成相聚和物浓度的影响

当接近临界点时，蛋白质均匀地分配于两相，分配系数接近于1。

如成相聚合物的总浓度或聚合物／盐混合物的总浓度增加时，系统远离临界点，系线的长度也增加，此时两相性质的差别也增大，蛋白质趋向于向一侧分配，即分配系数或增大超过1，或减小低于1。(2)体系中无机盐离子的影响盐离子在两相中有不同的分配，在两相间形成电位差，影响到带电荷生物大分子的分配。盐的种类对双水相萃取也有一定的影响,因此变换盐的种类和添加其他种类的盐有助于提高选择性在不同的双水相体系中盐的作用也不相同。在PEG/磷酸盐/水中加入氯化钠可以使万古霉素的分配系数由4提高到120,而在PEG/DeX/水体系中只从1.55提高到5。(3)体系PH的影响pH会影响蛋白质中可以离解基团的离解度，因而改变蛋白质所带电荷和分配系数。pH也影响磷酸盐的离解程度，若改变H2PO4-和HPO42-之间的比例，也会使相间电位发生变化而影响分配系数。pH的微小变化有时会使蛋白质的分配系数改变2—3个数量级。(4)体系温度的影响

温度影响小,一般温度改变不影响产物的萃取。大规模操作一般在室温下进行,不需冷却。

(1)成相聚合物PEG对蛋白质有稳定作用,常温下蛋白质不会发生变性; (2)常温下溶液粘度较低,容易相分离; (3)常温操作节省冷却费用.

二、双水相萃取技术的应用1.双水相萃取法常用于胞内酶提取和精制已知的胞内酶约2500种，但投入生产的很少。原因之一是提取困难。胞内酶提取的第一步系将细胞破碎得到匀浆液，但匀浆液黏度很大，有微小的细胞碎片存在，欲将细胞碎片除去，离心分离是一种常用的方法，但非常困难。双水相系统可用于细胞碎片以及酶的进一步精制。要成功地运用两水相萃取的方法，应满足下列条件：欲提取的酶和细胞应分配在不同的相中；酶的分配系数应足够大，使在一定的相体积比时，经过一次萃取，就能得到高的收率；两相用离心机很容易分离。工程方面的问题

在进行工业应用时，需考虑达到萃取平衡所需的时间和两相分离的设备。

在两水相系统中，虽黏度高，但表面张力很低。因而进行搅拌时很易分散成微滴，故几秒钟即能达到平衡，且能耗也很少。两相分离则比较困难，这是由于两相密度差低和当处理匀浆液时，粘度较大。由于粘度较高会引起阻塞，可采用自动排渣的喷嘴分离机。PEG/盐更适合用重力沉降；PEG/DeX多用离心机。

在两水相系统中进行转化翻译功能，如酶促反应，可以把产物移入另一相中，消除产物抑制，因而提高了产率。这实际上是一种反应和分离耦合的过程，有时也称为萃取生物转化；如果发生的是一种发酵过程，则也称为萃取发酵，因而此时也可以把两水相系统称为两水相反应器。2.两水相反应器enzymeenzymeenzymeenzymeenzymeEnzymeticreactionsubstrateproductenzymeenzymeenzymeEnzymeticreactionwithATPS两水相生物转化反应应满足下列条件：催化剂应单侧分配；底物应分配于催化剂所处的相中；产物应分配在另一相中；要有合适的相比。如产物分配在上相中，则相比要大，反之则相比要小。这些条件不可能同时满足，分配理论也不完善，常需要根据试验选择最优系统和操作条件。三、双水相萃取技术的发展

1.PEG衍生物：在PEG上引入亲和基团或离子基团；

2.采用多级萃取。反胶团萃取发展历史

1977年瑞典伦德大学Albertsson

首先提出反胶团萃取分离蛋白质

20世纪80年代生物学家们开始认识到反胶团萃取的重要性国内自20世纪80年代起也开展了反胶团萃取技术研究1、胶团与反胶团的形成

将表面活性剂溶于水中，当其浓度超过临界胶团浓度(CMC)时，表面活性剂就会在水溶液中聚集在一起而形成聚集体，在通常情况下，这种聚集体是水溶液中的胶团，称为正常胶团(normalmicelle)。胶团：表面活性剂的极性头朝外，疏水的尾部朝内，中间形成非极性的“核”水非极性的“核”极性“头”非极性“尾”若将表面活性剂溶于非极性的有机溶剂中，并使其浓度超过临界胶团浓度(CMC)，便会在有机溶剂内形成聚集体，这种聚集体称为反胶团。反胶团：表面活性剂的极性头朝内，疏水的尾部向外，中间形成极性的“核”有机溶剂极性“头”极性的“核”非极性“尾”胶团萃取过程用反胶团技术萃取蛋白质时,用以形成反胶团的表面活性剂起着关键作用。现在多数研究者采用AOT(阴离子型)为表面活性剂。AOT是琥珀酸二(2-乙基己基)酯磺酸钠或丁二酸二异辛酯磺酸钠(AerosolOT)。溶剂则常用异辛烷

(2,2,4-二甲基戊烷)。形状：通常为球形，也有的为椭圆形或棒形。大小：半径一般为10nm，取决于反胶团的含水量W0。W0≌[H2O]/[Surf]

2、反胶团的形状和大小3、反胶束的溶解作用微水池溶解和分离作用：

反胶团的微水池的水可溶解氨基酸、肽和蛋白质等生物分子,为生物分子提供易于生存的亲水微环境.

反胶团萃取可用于氨基酸、肽和蛋白质等生物分子的分离纯化，特别是蛋白质类生物大分子。蛋白质溶解模型

a、水壳模型：蛋白质位于水池的中心，周围存在的水层将其与反胶团壁隔开；

b、半岛模型：pro表面存在强烈疏水区，该区直接与有机相接触；

c、pro吸附于反胶团内壁；

d、pro疏水区与几个反胶团的S疏水尾发生相互作用，被几个小反胶团所“溶解”。溶解作用机理A 静电作用

当溶质所带电荷与表面活性剂相反时,由于静电引力的作用,溶质易溶于反胶团,溶解率或分配系数较大,反之,则不能溶解到反胶团相中。右图：在带正电荷的pH范围内，蛋白质的溶解率接近100%,说明静电相互作用对蛋白质的反胶团萃取起决定性作用。B 空间相互作用

盐浓度增大对反胶团相产生脱水效应,含水率W0随盐浓度的增大而降低,反胶团直径减小,空间排阻作用增大,pro溶解下降.

在各pro的pI处，反胶团萃取实验研究表明:随着M增大,pro的分配系数(m,溶解率)下降。当M>20KD时,m很小.表明随M增大,空间排阻作用增大,pro的溶解率降低.根据pro间M的差别可以选择性对pro进行萃取分离。C 疏水性相互作用

aa的疏水性各不相同,研究表明,aa或多肽的m随aa疏水性的增大而增大,蛋白质的疏水性影响其在反胶团中的溶解形式,因而影响其分配系数.4、反胶团的制备5、影响反胶团萃取蛋白质的主要因素对于阳离子表面活性剂、溶液的pH值需高于蛋白质的pI值，反胶团萃取才能进行；对于阴离子表面活性剂，当pH＞pI时，萃取率几乎为零。水相pH值pH对蛋白质萃取率的影响离子种类影响含水率，随反离子半径的增大而下降。离子强度

a.离子强度增大后，反胶团内表面的双电层变薄，减弱了蛋白质与反胶团内表面之间的静电吸引，从而减少蛋白质的溶解度；b.

盐浓度的增大，反胶团产