瓜子金皂苷己对mpp

瓜子金皂苷己对mpp

帕金森病（parkinsonue679sdiseases，pd）是一种常见的慢性神经退行性疾病，临床表现为镇静振动、肌肉僵硬和运动迟缓。病变的病理变化主要是严重的黑质环境区（sn）。多媒体神经退行性死亡和缺失。目前该病的发病机制尚不明确,但有研究表明,在PD中选择性多巴胺能神经元损伤与细胞凋亡密切相关。MPP+(1-methyl-4-pheny1-pyridinium)是一种多巴胺能神经元毒性剂,被广泛应用于PD发病机制和药效学评价的研究。瓜子金(PolygalajaponicaHoutt.)别名金钥匙,小远志等,为远志科远志属植物,具有祛痰止咳,宁心安神等功效。瓜子金皂苷己(polygalasaponinF,PS-F)是瓜子金提取物,为齐墩果烷型三萜皂苷。体外研究发现,瓜子金皂苷己对MPP+导致PC12细胞的损伤具有保护作用,本研究初步探讨瓜子金皂苷己对MPP+损伤PC12细胞保护作用的机制,为其应用于PD的临床治疗提供理论依据。1材料表面1.1从中国科学院基础医学研究所细胞中心购买pc12细胞菌，该细胞将被传唤并保存1.2mtt--actin抗体和培养基DMEM及马血清(Gibco公司);胎牛血清(Hyclone公司);MPP+、噻唑蓝[3-(4,5-dimethyhhyhhiazol-2-y1)-2,5-diphenyhetrazoliumbromide,MTT]、β-actin抗体(Sigma公司);AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒(北京宝赛生物技术有限公司),JC-1线粒体膜电位检测试剂盒(碧云天生物技术研究所);BCA蛋白定量试剂盒、ECL化学发光检测试剂(北京普利莱基因技术有限公司);Caspase-3抗体(CellSignalingTechnology);HRP标记的羊抗兔IgG抗体(SantaCruz);其他试剂为国产或进口分析纯试剂。1.3显微镜选择1.2ECL检测系统型号:柯达EDAS-120;酶标仪型号:ThermoSKANITSOFTWARE3.2;倒置显微镜型号:Olympus,IX70-142;流式细胞分析仪:BDFACSCalibur。2方法2.1pc12细胞培养和分离PC12细胞置于含5%胎牛血清、5%马血清的高糖DMEM培养基中,在37℃、5%CO2的孵育箱中培养,每隔48h换培养液,当单层培养细胞汇合80%以后,传代培养。实验时将PC12细胞传入培养板中,待细胞进入对数生长期进行试验。实验分为空白对照组、MPP+处理组、MPP++瓜子金皂苷己(0.10、1.00、10.00μmol·L-1)处理组,共5组。2.2mtt法对细胞的存活率进行检测2.2.1mtt法检测细胞存活率PC12细胞按5×107·L-1浓度接种于96孔板中,每孔100μl(5000个细胞/孔),培养24h,加入含有浓度为100、250、500、750、1000μmol·L-1MPP+的培养基处理,每组设6个复孔,继续培养48h,MTT法检测细胞存活率。2.2.2ps-f对破坏细胞存活率的影响细胞接种于96孔板,24h后,按组别分别给予相应处理,每组设6个复孔,继续培养48h,MTT法检测细胞存活率。2.2.3dmso-ldmso法每孔加入10μlMTT,37℃、5%CO2的孵育箱中孵育4h,弃培养基,每孔加入100μlDMSO,震荡至晶体颗粒溶解,10min后在酶标仪上测定570nm处的吸光度(A)值。细胞存活率/%=(实验组平均A值/对照组平均A值)×100%。2.3pi和/pv-同型半胱氨酸钠pi的检测用0.25%的胰酶消化细胞,悬浮于无血清DMEM中,4℃、1500r·min-1离心5min,预冷的PBS洗1次,细胞重悬于200μlBindingBuffer,加入10μlAnnexinV-FITC室温避光反应15min,加入5μlPI和300μlBindingBuffer,室温反应5min后上机检测。2.4荧光显微镜观察37℃无血清的DMEM洗涤细胞1次,每孔加入1.5ml的JC-1(5mg·L-1),37℃、5%CO2培养箱孵育20min,DMEM洗2次,倒置荧光显微镜下观察。2.5重组人细胞nfm和b.n-l-1-2和蛋白酶抑制剂ris收集细胞,预冷PBS洗两遍,加入细胞裂解液(1%NonidetP-40,150mmol·L-1NaCl,50mmol·L-1Tris,pH7.4,1mmol·L-1EDTA和蛋白酶抑制剂),置于冰上裂解30min后,4℃,12000r·min-1离心30min。取上清,BCA试剂盒蛋白定量,细胞总蛋白加入上样缓冲液煮沸变性。20μg蛋白经10%SDS胶分离后转移到PVDF膜,3%BSA室温封闭2h,加入一抗4℃过夜,TBS-Tween洗膜后加HRP标记的二抗,室温孵育2h,加入ECL发光液,进行检测。2.6统计分析3结果3.1mpp+浓度对小鼠细胞存活率的影响MTT检测结果(Fig1)显示,正常PC12细胞给予不同浓度MPP+48h后,细胞存活率随药物浓度的增加而剂量依赖性降低。当MPP+浓度在500μmol·L-1时,细胞存活率基本维持在60%左右。为使细胞处于损伤状态又不致使细胞过度死亡,选择500μmol·L-1作为后续实验浓度。3.2瓜子金皂苷对小鼠细胞存活率的影响MTT结果(Fig2)显示,500μmol·L-1MPP+导致PC12细胞存活率下降,同时给予不同浓度瓜子金皂苷己可增加细胞存活率,在0.10、1.00、10.00μmol·L-1范围内具有浓度依赖性,其中1.00和10.00μmol·L-1浓度组与MPP+处理组比较差异有显著性。3.3ps-f对不同比例小鼠细胞凋亡的影响采用AnnexinV/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡的变化,研究瓜子金皂苷己对MPP+诱导PC12细胞凋亡的影响。结果(Fig3)显示的是细胞凋亡分析的二维散点图,其中左下象限显示活细胞,为FITC-1/PI-1;右下象限是早期凋亡细胞,为FITC+1/PI-1;右上象限是晚期凋亡或坏死细胞,为FITC+1/PI+1;左上象限为死亡细胞,为FITC-1/PI+1。由图可见,在检测过程中正常PC12细胞有少量的损伤凋亡。经MPP+处理后早期凋亡是其受损的主要形式,细胞凋亡率由空白组的2.68%增加到54.81%。在造模同时加入PS-F能减少细胞早期凋亡率,0.10、1.00、10.00μmol·L-1浓度组早期凋亡率分别为39.04%、33.43%、29.73%,呈剂量依赖性降低,从而使活细胞比例增加。表明实验浓度的PS-F能在一定程度上抑制MPP+诱导细胞发生早期凋亡,保护PC12细胞免受损伤。3.4细胞线虫膜电位结果(Fig4)显示,正常PC12细胞呈均匀的强红色荧光,表示线粒体膜电位正常,仅有(5.51±1.84)%的细胞线粒体膜电位降低;经MPP+处理后,红色荧光强度减弱,绿色荧光增强,线粒体受损,有(76.71±4.31)%细胞线粒体膜电位降低;造模同时加入0.10、1.00、10.00μmol·L-1浓度的PS-F,红色荧光逐渐增强,绿色荧光减弱,能够抑制线粒体膜电位降低,分别为(55.19±2.84)%、(36.75±1.47)%、(23.61±2.23)%,表明实验浓度的PS-F能浓度依赖性的抑制MPP+损伤线粒体膜电位的降低,维持线粒体稳定。3.5mpp+损伤caspase-3的表达Caspase-3是细胞凋亡发生的重要执行蛋白之一,在正常细胞主要以其前体procaspase-3的形式存在无酶活性,细胞发生凋亡后形成有活性的Caspase-3,其分子量为17ku。Westernblot结果(Fig5)显示,在正常细胞中没有活性Caspase-3的表达,经MPP+损伤后Caspase-3的表达明显升高,而不同浓度PS-F组能浓度依赖性的降低活化Caspase-3的表达。结果表明PS-F对抗MPP+诱导的凋亡与调节凋亡相关蛋白的表达有关。4ps-f对caspase-3诱导pc12细胞凋亡的影响PD是一种由多巴胺能神经元选择性丢失引发的运动功能障碍性疾病。其发病机制尚未明确,越来越多的研究表明选择性多巴胺能神经元损伤及神经元凋亡与PD的发生密切相关。凋亡是细胞程序性死亡的一种形式,在凋亡过程中,细胞体积缩小,细胞质密度增加,线粒体功能改变,核破碎等。线粒体作为细胞能量合成、贮存、转化及物质代谢的重要场所,在细胞凋亡过程中会产生一系列的变化:线粒体膜通透性增加,跨膜电位消失,释放Caspase激活因子(如细胞色素C)等,在细胞凋亡进程中起枢纽作用。Caspase是近年来发现的一组存在于胞质中的半胱氨酸蛋白水解酶,能够特异的水解天冬氨酸残基后的肽键,导致细胞凋亡。在细胞中,Caspase均以无活性的酶原状态存在,可由线粒体释放的细胞色素C介导激活。Caspase蛋白家族一旦被激活后便不可逆的启动细胞死亡程序。PC12细胞为大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞克隆的细胞株,它能表达酪氨酸羟化酶并合成多巴胺,因此也常用来作为研究多巴胺能神经元的有利工具。MPP+是MPTP在体内的活性代谢产物,能够选择性的抑制线粒体传递链复合物I,改变线粒体外膜通透性,导致细胞质内细胞色素C的含量增加,促进凋亡蛋白(包括Caspase-3)的表达。线粒体膜电位(MMP)下降是早期细胞凋亡过程中不可逆的变化。JC-1是一种特异性阳性染料,在MMP较高时,以聚合物形式聚集在线粒体的基质中;MMP较低时,JC-1以单体形式存在于线粒体的胞质中。在490nm波长下可以激发单体产生绿色荧光,聚集体产生红色荧光,据此可判断MMP的变化。荧光显微镜观察MPP+处理后细胞MMP明显下降,而PS-F可明显提高MMP。此结果与AnnexinV/PI双染流式细胞术检测的结果一致。Caspase-3作为细胞发生凋亡的重要执行蛋白之一,是PD患者与动物模型脑中黑质多巴胺能神经元凋亡的易感因子和最终效