瓯柑茎尖分生组织的微芽嫁接脱毒效果研究

瓯柑茎尖分生组织的微芽嫁接脱毒效果研究

茴香是浙江省温州独特的抗贮藏性优良品种，贮藏时间超过250天。然而，由于柑橘黄龙病的破坏，莲花产业的发展非常困难。欧美各国早在20世纪世纪80年代,就开始系统地研究各类果树的脱毒技术和病毒检测方法,获得了一大批无病毒苗木。20世纪90年代以来,又着重开展了果树良种繁育体系的建立,推行果树无病毒化栽培。20世纪90年代美国柑橘增产五成,一个重要的原因是定植无病毒苗木。随着国际国内柑橘市场的变化,许多优良地方品种和引进的优良品种需要扩大繁殖,但通常从STG脱毒到提供健康接穗需要1.5～2a的时间,茎尖微芽嫁接缓苗期长,生长慢的问题制约了新品种的推广和应用。采用茎尖微芽嫁接脱除黄龙病病原已证明是获得无病毒苗木的有效方法,所取茎尖的大小对脱毒效果和嫁接成活率有着明显的影响。针对黄龙病脱毒技术并没有相关的详细资料可寻。本试验旨在利用PCR分子检测手段,分析确定茎尖微芽嫁接时,脱除柑橘黄龙病所需的最适茎尖大小,从而协调好提高脱毒率与提高嫁接成活率之间的矛盾。同时,为了加快无病毒苗生长速度,满足市场规模化生产的需要,本课题就加速试管苗生长技术进行了研究。1材料和方法1.1叶片的制备从浙江省丽水市林业科学研究所提供的2a生瓯柑苗木上,采得叶片样品,经液氮处理后,贮存在-70℃超低温冰箱中。从福建省农业科学院采集接种了经鉴定的黄龙病病原,并表现出黄化斑驳症状的长春花叶片作阳性对照。1.2常规消毒处理冰糖橙(C.sinensisOsbeck)作过渡性砧木。取新鲜种子经去果胶处理后,移到超净工作台上,进行常规消毒处理。去种皮后,将种子接种到MT培养基中,在(26±1)℃,暗培养2周,获得黄化苗用作嫁接砧木。1.3叶原基大小对微芽嫁接当新梢长至1～2cm时,采嫩芽作接穗。表面消毒后,在双目实体显微镜下,剥取含有生长锥及1、2、3、4个叶原基的不同大小的茎尖分别进行微芽嫁接,嫁接操作根据文献进行。每种大小的茎尖嫁接60个,分多次进行,嫁接速度为20～25芽/h,每次约需1h。嫁接成活后,及时除萌,待试管苗长出真叶,叶片长约2cm时,将试管苗移入无菌培养土中。待试管苗长出4～6片叶时,取样作黄龙病病原检测。1.4pcr扩增试验根据文献提取脱毒前后样品及对照样品中的DNA,在Ultrospec2100proUV/VisibleSpectrophotometer上测定DNA浓度,并将其浓度稀释为500ng/μL,待PCR检测用。根据VILLECHAMOUX等的报道,设计黄龙病亚州株系特异性引物,用于PCR试验。引物由上海生工生物技术公司合成,引物序列为:①(+)5′-TGAATTCTTCGAGGTTGGTGAGC-3′;②(-)5′-AGAATTCGACTTAATCCCCACCT-3′。PCR扩增反应在PTC-100PeltierThermalCycler(MJResearch)热循环仪中进行。采用TaKaRaPCRKit进行PCR反应,参考说明书中基本操作进行试验。经试验采用的最佳扩增条件为:94℃开始变性5min,接着,94℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸1min,进行33个循环,72℃再延伸7min。PCR扩增产物经2%的琼脂糖凝胶(Mersco),在70V电压下电泳50min,溴乙淀染色,然后在凝胶成像系统中观察。1.5试苗的制作准备生长健壮的枳橙砧木,砧木离地10cm处干茎约为0.8～1.2cm为宜。在离地面10～20cm处剪去上部枝梢,在垂直方向切一长度为1.5cm的切口。当试管苗移栽成活,生长2个月时,用锋利的手术刀将试管苗砧木处削成契形,切面长约1.5cm,将试管苗靠一边形成层对齐,用塑料带梆紧,用塑料袋将嫁接口以上部分套袋,保湿。以上操作在气温为25～30℃条件下进行。2结果与分析2.1嫁接成活率对茎尖叶原基的影响利用带有明显黄化斑驳症状的母本植株进行茎尖嫁接试验,结果表明:茎尖大小对茎尖微芽嫁接的成活率有明显的影响。当茎尖含1个叶原基时,成活率最低,为11.1%,当茎尖含2个叶原基时,成活率为47.7%,茎尖含3个和4个叶原基时,嫁接成活率分别为62.2%和78.8%(表1)。观察发现,嫁接后1周,很容易判断砧穗是否愈合,如果没有成活,茎尖会变成褐色或枯萎的点状物,应立刻去除。如果不去除,因伤口刺激嫁接口很容易产生萌蘖,当苗继续生长时,难以辨别是真正的接穗愈合还是萌蘖产生。有少数情况是茎尖既不枯萎也不继续生长,这种类型的试管苗到3～4周时,芽如果还不能迅速抽出,就没有利用价值。据观察,嫁接成活1～2周时,茎尖叶原基的多少与试管苗的叶子数是相符合的(图1)。当生成锥继续生成2～3周时,中心也会形成新的小嫩叶。方差分析结果表明:4种情况下的嫁接成活率均存在着显著差异,而含1和2个叶原基与含4个叶原基的脱毒率差异极显著(P<0.01),与含3个叶原基的脱毒率比较差异不显著(表1)。2.2叶原基嫁接检测对不同大小茎尖微芽嫁接成活的试管苗进行黄龙病PCR检测,结果表明:当茎尖含有1个叶原基和2个叶原基时,全部被检测样品均未扩增出黄龙病特异性片段,而阳性对照和瓯柑母本植株可以扩增出特征片段,用2%的凝胶电泳,在凝胶成像系统中可以观察到约535bp长的带。茎尖含有3个叶原基嫁接获得的样品,可以检出4.3%的带毒率,茎尖含有4个叶原基嫁接获得的样品,可以检出27%的带毒率(见表1和图2),由此可见,随着茎尖的增大,带病毒的机率是增加的。在进行STG脱除黄龙病的工作时,在熟练的嫁接操作条件下,含有2个叶原基的茎尖嫁接成活率为47.7%,但能完全将病毒脱掉,当茎尖更大时,尽管茎尖嫁接成活率明显提高,但不能完全彻底地脱除病毒。由此可见,剥取适宜大小的茎尖分生组织用于STG是保证良好的脱毒效果的关键。2.3茎尖嫁接苗移栽后,其嫁接后的生长情况检测,结果见表1二次嫁接试验表明,茎尖微芽嫁接苗移栽2个月时,试管苗总长度平均为16cm(图3-a),可用作接穗进行二次嫁接,嫁接时,在过渡砧木上切成契型斜面,其面积比直接在接穗上切的面积大,以便于愈合。由于接穗上保留了叶片,用套袋的方法保湿,嫁接后约10d即可愈合,叶片可以进行光合作用,快速恢复生长。本试验二次嫁接了35株STG苗,早上7:00～9:00在网室中进行,操作分3次完成,成活32株,培养12个月时,茎尖微芽嫁接接口以上枝梢长度平均为27.1cm,32株对照植株的枝梢长度平均为19.1cm,小样本平均数差异测验(t测验)表明,瓯柑二次嫁接与茎尖嫁接苗直接移栽比较,其接穗长度差异非常显著。图3-b为二次嫁接10d时发出新芽,图3-c显示,从STG开始12个月时,二次嫁接苗比STG苗生长速度加快。3茎尖微芽嫁接脱毒试验NAVARRO等指出,0.14～0.16mm的茎尖能有效地脱掉病毒。对柑橘甜橙、温州蜜柑品种进行脱毒时,不能照搬前人的做法,因为含相同数目的叶原基的柚类的茎尖比甜橙和温州蜜柑的茎尖大2～3倍,有时需要将茎尖进行切分,保留生长锥和1到2个叶原基用于微芽嫁接。在单纯用茎尖培养或茎尖嫁接难以完全脱毒时,可以考虑用茎尖培养与热处理或茎尖培养与化学处理的方法以结合,以达到理想的脱毒效果。但不能排除上述方法照成的负面影响。本试验进一步说明,应该在保证理想的脱毒率的前提下,注意获得尽可能高的成活率。本试验证明以切取含有生长锥和2个叶原基的茎尖分生组织用于STG操作是达到理想的黄龙病脱毒效果的最佳选择。