第2章 菌种的来源、生物活性物质的筛选和菌种保藏

第二章生产菌种来源、生物活性物质的筛选和菌种保藏发酵工业生产水平的三个决定要素:生产菌种的性能发酵和提取工艺条件生产设备获得优良的生产菌种是实现高水平发酵工业生产的第一环节.第一节菌种来源根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；从大自然中分离筛选新的微生物菌种。

一、微生物是生物活性物质的丰富资源微生物资源丰富，广布于土壤、水和空气等自然界中，种类之多至今仍是一个难以估计的未知数。它们除了能生活在动、植物可以生长的环境中外，还可以生活在动、植物不能生长的环境中，为适应环境对它们生存造成的压力，它们进化出许多特殊的生理活性物质。所以微生物过去、现在以及将来都是人类获得生物活性物质的丰富资金源。1、微生物工业上常用菌种：细菌、放线菌、真菌（酵母菌、霉菌）常用的细菌

大肠杆菌应用：对谷氨酸定量分析，生产天冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸。

乳酸杆菌应用：乳酸、干酪、奶子酒、发面、泡菜、酸奶等的制作枯草芽孢杆菌应用：生产淀粉酶放线菌种类：龟裂链霉菌、金霉素链霉菌、灰色链霉菌、红霉素链霉菌应用：各类抗生素。土霉素、四环素、链霉素、红霉素酵母菌种类：酒精酵母、啤酒酵母、假丝酵母红酵母、面包酵母

应用：生产酒精、啤酒、石油发酵脱蜡和制取蛋白质、生产脂肪面包酵母啤酒酵母红酵母霉菌曲霉属应用：生产有机酸、生产淀粉酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶应用：酱油、酱类（淀粉酶）米曲霉应用：产糖化酶和蛋白酶、主要用于酿酒制曲和酱油制曲应用：生产甲义丁二酸

毛霉应用：可以产生蛋白酶，我国多用于豆腐乳、豆豉等的制作根霉种类：米根霉、华根霉、少根根霉、爪哇根霉应用：酿酒青霉菌应用：生产青霉素、葡萄糖氧化酶C菌株分离（isolation)就是将一个混杂着各种微生物的样品通过分离技术区分开，并按照实际要求和菌株的特性，采取迅速、准确、有效的方法对它们进行分离、筛选，进而得到所需微生物的过程。2、菌种分离与筛选工作程序发酵工业上使用的微生物菌种，最初都是从自然界中分离筛选出来的。分离与筛选菌种的具体做法一般分4个步骤：样品采集增殖培养纯种分离生产性能测定★培养分离中要解决的问题（1）“分离什么和从哪里分离出?”（2）必须充分考虑所分离微生物的生产能力、生长速度、生物群体培养和产品生产工艺及其提纯的难易和费用，工业生产发酵罐中稳定性及遗传操作的难易程度等。（3）选择适宜的培养分离方法和检测方法。

调查研究（包括资料查阅）试验方案设计

采样第一次增殖培养第一次平板分离第二次增殖培养第二次平板分离增殖条件探索根据实际情况进行定量或半定量测定第一次原种斜面第二次原种斜面初筛（1株1瓶）定量或半定量测定筛选工作程序第三次平板分离第三次原种斜面复筛第四次平板分离不纯第四次原种斜面再复筛种子培养初步工艺条件摸索较优菌株1株3-5瓶保藏及进一步做生产性能试验或作为育种的出发菌株某些必要试验和毒性试验第三次菌种保藏二、含微生物样品的采集较复杂；应根据分离目的灵活掌握土壤（丰富、5-25cm、土质、酸碱度、植被状况、地理条件、季节）食品、海水、动物、植物、极端环境根据微生物的营养类型采样森林土中有相当多枯枝落叶和腐烂的木头，富含纤维素，适合利用纤维素作碳源的纤维素酶产生菌生长。肉类加工厂附近、饭店排污沟，易分离到蛋白酶和脂肪酶产生菌。面粉加工厂等场所易分离到产淀粉酶、糖化酶的菌根据微生物的生理特性采样筛选高温酶产生菌通常从温泉、火山爆发处、堆肥等采样；筛选产低温酶的微生物，可从冰窖、南极、深海等采样分离耐高渗透压酵母菌，可到甜果、蜜饯、甘蔗渣堆积处采样第二节菌种的分离★

菌种的分离方法概括为两大类：一、施加选择性压力分离法因为不同种类微生物其生长繁殖时对环境和营养的要求不同，如温度、PH、渗透压、氧气、碳源和氮源等。培养时，人为控制这些条件，使之利于某类或某种微生物生长，而不利于其它微生物的生存，以达到使目的菌种占优势，而得以快速分离纯化的目的。二、随机分离法有些利用微生物生产的目的产物对菌种的筛选没有直接的指示作用，因此常采用随机分离法进行分离。如：抗生素、抗肿瘤药物、酶抑制剂、抗病毒药物、生长因子产生菌、免疫激活剂、多糖等生产菌。一、施加选择性压力分离法

1、富集(enrichment)培养

是在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，使目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种，以利分离到所需的菌株。

其要领是提供一些有利于所需菌株生长或不利于其他菌型生长的条件，例如，供给特殊的基质或加入某些抑制剂。控制氧可将好氧微生物和厌氧微生物分开；高温下培养可将嗜热微生物和非嗜热微生物分开；控制pH可分离嗜酸或嗜碱微生物；高糖或高盐培养基可分离耐高渗透压微生物；

需注意，所需菌型生长的结果有时会改变培养基的性质，从而改变选择压力。

重复移植几次后接种少量已富集的培养物到固体培养基上。

移植时间是关键，应在所需菌种确已占优势的情况下进行。自生固氮菌的分离2、利用固体平板的生化反应进行分离（方法之一）

利用特殊的分离培养对大量混杂微生物进行初步分离的方法。

分离培养基是根据目的微生物特殊的生理特性或利用某些代谢产物生化反应来设计的。

可显著提高分离效率透明圈法变色圈法生长圈法抑菌圈法1）、透明圈法

分离水解酶产生菌时较多采用，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、核酸酶等；

在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊；

能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈，圈的大小初步反应菌株利用底物的能力。

透明圈的大小不能完全作为选择高产菌的依据，因为在深层培养中的产酶单位与平板上圈的大小之间并不完全成正比。

但作为初筛的手段是有意义的2）、变色圈法

对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底物平板中加入指示剂或显色剂，使目的微生物菌落周围呈现变色圈，从而能被快速鉴别出来；用含0.2%果胶为唯一碳源的培养基平板，对含微生物样品进行分离，待菌落长成后，加入0.2%刚果红溶液染色4h，具有分解果胶能力的菌落周围便会出现绛红色水解圈。如筛选果胶酶产生菌甘油三丁酸酯为底物罗丹明B为指示剂荧光圈又如分离解脂微生物豆油作底物中性红（红～黄.6.8～8.0.）指示菌落周围呈红色圈3）、生长圈法

通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素的产生菌将待检菌涂布于高浓度工具菌并缺少所需营养物的平板上进行培养，若某菌株能合成平板所需的营养物，在该菌株的菌落周围便会形成一个混浊的生长圈

工具菌（指示菌）是一些相对应的营养缺陷型菌株如嘌呤营养缺陷型大肠杆菌与不含嘌呤的琼脂混合倒平板，在其上涂布含菌样品保温培养，周围出现生长圈的菌落即为嘌呤产生菌4）、抑菌圈法

常用于抗生素产生菌的分离筛选据估计，筛选1万个菌株才能得到1株有用的抗生素产生菌；因此，设计一个准确、快速的筛选模型十分重要。抑菌圈法是常用的初筛方法

工具菌采用抗生素的敏感菌若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质，如抗生素等，便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈3、放线菌的分离放线菌大量存在于土壤中。许多放线菌既可以产生抗生素(目前发现的几千种抗生素中，有一半以上是由放线菌产生的）和具有生物活性的次生代谢物质，又可以用于生物处理废物过程。1）、分离源的选择可选择土壤：耕地、水田、河湖岸边、平地森林、山地森林、山地草原和牧场植物材料：根、叶、落叶、堆肥、干草。河、湖、海的水及其底泥。2）、用于分离放线菌的预处理技术干热处理：土壤在120℃或100℃干热处理能够极大地减少分离平板上的丝状细菌和链霉菌。杀菌剂苯酚（1.5%）、葡萄糖酸洗必泰（CG0.01%)和苄索氯铵（BC0.01%):不同的放线菌孢子对杀菌剂的抗性不同。链霉菌的孢子和杆菌及假单孢菌的营养细胞用苯酚、CG和BC有30℃处理30min即被杀死；相反的，小双孢菌属的孢子对各种杀菌剂都有相当强的抗性。3）、抑制剂的选择在放线菌分离琼脂中通常都加入重铬酸钾或放线菌酮，以抑制真菌、细菌的繁殖。4）、放线菌分离方法研究的发展趋势一是：深入研究稀有放线菌的生态分布、生理特性及其他特殊性质，以设计出适合不同类群菌株的分离方法。二是：向特殊的生态环境发展，如海洋等极端环境，从中分离极端类群以获得新的物种资源。4、自然界中细菌的分离1）．土样采集方法森林、旱地，草地可先掘洞，由土壤下层向上层顺序采集；水田等浸水土壤在不损土层结构的情况下插入圆筒采集。如果层次要求不严格，可取离地面5～15cm处的土。将采集到的土样盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中。在采集植物根际土样时，一般方法是自土壤中慢慢拔出植物根，在大量无菌水中浸渍约20min，洗去粘附在根上的土壤，然后再用无菌水漂洗下根部残留的土，这部分上却为根际土样。土样中细菌的富集：适度稀释后，取0.1m1涂布已添加及未添加富集底物(如几丁质、纤维素等)的土浸出汁平板。2）．植物体采集方法在采集叶面时，一般是用灭菌的剪刀、打孔器、安全刀片等，由几片新鲜叶片的同一部位切取一小块，并注意不要损伤周围边缘。选择叶面时应考虑叶位、叶龄、叶片正反面和在一片叶上的取样部位。采集植物根及根系时，方法与根际土样采集方法相似。将洗净的根装入采样袋中，采集根系时，一般与根际土样一起保存。

植物体上细菌的分离：无菌富集，加植物浸出液适度培养取样，洗涤，取1ml经适度稀释后涂布平板。

3）．水样采集方法用于细菌检测的水样应收集于100m1干净、灭菌的广口塑料瓶中。由于表层水中含有泥沙，故在采样时应在较深的静水层中采集水样。方法是：握住采样瓶底浸入水中30-50cm处，然后瓶口朝下打开瓶盖，让水样进入。如果有急流存在的话，应直接将瓶口反向于急流。采集瓶从水中取出时应迅速并带有较大的弧度。水样不应装满采样瓶。所有水样都应在24h之内迅速进行检测，或者4℃下贮存。水中细菌的分离：水样通过0.22μm无菌滤膜，取出滤膜用1ml无菌稀释液将滤膜上的沉积洗下。用样本稀释液适度稀释,涂布平板倒置培养或滤纸压印分离法。4）、生态学参数及培养基

的组成原则A、加入培养基中的天然提取物种类和用量、环境生物物理学参数以及用于平板涂布分离样本的溶剂都会影响实验中所要分离的细菌的数量和种类。B、就分离培养基的组成而言，部分培养基中必须含有10-50%的天然提取物。加入培养基中的天然提取物，部分培养基中则应含有多种碳、氮源，如几丁质、纤维素或果胶。C、所有分离培养基中都应含有抗真菌剂(如放线菌酮和制霉素)，掺加浓度一般为50~100μg／m1，以抑制真菌的生长。D、琼脂平板在使用前应置于37℃培养箱中孵育l~2天。E、培养基的生物物理学参数，如pH及盐分也应调节到与试样的生态系统参数值相近。5、真菌分离1)、利用低碳／氮比的培养基可使真菌生长菌落分散，利于计数，分离和鉴定。这里主要是利用营养成分的减少而使生长减慢，并由此限制扩散性真菌的生长。2)、改变培养温度将有利于不同嗜温区真菌的分离。3)、有时，真菌子实体形成必须有光线，这在分离培养时应加以考虑。4)、选择性富集：是通过一定的方式使样本中一种或一群微生物数量上的增加而利于分离的一种技术。富集可以是种水平的，如通过营养要求的改变来富集分离镰刀菌；也可以是组成群水平的，如以纤维素为唯一碳源的选择性培养基可选择性富集所有能降解纤维素的纤维素裂解微生物。5)、选择性抑制培养基可使非目标微生物消除或减少到一定程度。在分离培养基中加入一定的抗生素即可有效地抑制细菌生长及菌落形成。真菌的分离方法土中真菌的分离：稀释法，混入法，压贴法，粘附法，浮选法，注射器采集法，土过筛法，蔗糖密度梯度离心法。植物材料中真菌的分离：植入法，压贴法，洗涤法，浸泡法。水中真菌的分离：水样稀释后涂布分离。饵诱技术常用于水中真菌的富集。子实体直接分离培养担子菌：新采集的子实体组织植入平板内或在放于液体培养基表面放一小块无菌滤纸上培养。二、

生物活性物质的筛选微生物是丰富的、多样的具有生物活性化合物的聚宝盆，代谢产物具有结构以及生物活性的多样性，可以抑制与疾病靶标相关的酶途径。从1940年到1980年间，天然产物的筛选主要着重于发现治疗微生物感染的新抗生素。1980年后，天然产物的活性筛选已经不局限于单一的抗生素了，还注重寄生虫、抗癌、抗真菌、抗病毒以及降血脂、免疫调节等方面。生物活性物质的筛选就是通过有效的方法获得一定数量和质量的候选化合物。1、靶标的确定生物活性物质筛选中所确定的与人类疾病或致病菌相关的靶位，一般来说都是一些酶、受体、结构蛋白、转录因子，或者是更复杂的信号传导中的某一途径。用得较多的是激酶、激素受体、G蛋白偶联体、离子通道以及免疫系统调节因子等。基因组学、蛋白质组学等组学研究与生物信息学的结合，为鉴定大量新的靶位提供了可能。高通量筛选（highthroughoutscreening）也使得最终筛选到的生物活性物质已不仅仅局限于小分子化合物，甚至还包括了蛋白质、多肽和一些调节因子。高通量筛选（highthroughputscreening):将许多模型固定在各自不同的载体上，用机器人加样，培养后用计算机记录结果，并进行分析，使筛选从繁重的劳动中解脱出来，实现大规模筛选。

细胞模型：观察待测样品对细胞的作用，只能反映药物对细胞生长等过程的综合作用，不能反映作用的途径和靶点。包括各种正常细胞和病理细胞。

分子模型：包括受体、酶，其特点是药物作用的靶点明确。通过高通量筛选方法，可以发现效果好、临床应用价值高的创新药物，治疗疑难病症。1）、抗肿瘤活性化合物的筛选研究发现至少有25%的人类肿瘤的发生是与一种突变的ras基因有关的。致癌类型的Ras蛋白（GTP结合蛋白）缺失了GTP酶活性，导致持续激活的结合GTP的Ras不停地传递信号到胞内。因此Ras是一个靶标。2）、酶抑制剂的筛选

选择与生理和病理关系明确的酶作为靶酶

靶区靶酶抗高血压血管紧张素转移酶抗糖尿病-淀粉酶、蔗糖酶等抗血脂症缩合酶抗组氨组氨酸脱羧酶、组氨-N-甲基转移酶2、各种生物活性物质的筛选3）、抗病毒活性药物的筛选◆到目前为止，人们对病毒感染的疾病还缺乏有效的治疗方法，很大程度依赖疫苗的预防。◆目前对HIV、流感病毒的研究是瞄准它们复制过程中的一些关键酶途径，比如HIV病毒复制过程中合涉及整合酶、逆转录酶、蛋白酶等。以这些酶或编码的基因为靶标筛选的抑制剂在体外都显示了很强的抑制病毒复制的活性。3、筛选方法配基结合分析酶法分析基于报告基因的分析第二信使分析酵母双杂交系统1）配基结合分析经常作为免疫分析的一种，是在找到一个靶标蛋白的基础上来寻找它特异性的配基，这样的靶标很多情况下都是一个受体。与之结合的除一些小分子激素外，一些多肽、DNA甚至RNA也能和目标蛋白发生交互作用。为了准确检测出所结合的配基，通常需要一个标记，结合上去的配基可以通过这个标记直接地检测，或与其他可检测的物质结合来测定。筛选时可避免烦琐的分离纯化过程，细胞抽提粗品或者经过简单的膜分离的样品就可以用来筛选。2）酶法分析在一个反应体系中，通过测定不同时间点的产物产生量或是底物的消耗量，来计算所筛选的物质对酶活性的影响。这一方法很容易应用到高通量筛选中，有很多底物可以方便地用荧光强度的检测来筛选。如：可以采用一个高灵敏性的ATP依赖的荧光素酶来检测反应体系中ATP的使用情况，从而估算反应进程。3)基于报告基因的分析报告基因(reportergene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的