蛋白质的提取与分离纯化

1第五节层析分离层析法也称色谱法，是1903年俄国植物学家MichaelTswett发现并命名的。将植物色素溶液通过装有CaCO3吸附剂的柱子，然后用石油醚淋洗，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开。2一、吸附层析（adsorptionchromatography）

1、原理利用吸附剂对不同组分的吸附力不同进行分离。31、原理吸附作用的强弱主要与吸附剂和被吸附物质的性质有关。

吸附层析的关键：吸附剂和洗脱剂的选择。一、吸附层析42、洗脱方法溶剂洗脱法置换洗脱法前缘洗脱法一、吸附层析53.吸附剂

吸附剂通过范德华力、静电引力、疏水作用等与待分离物质的极性官能团作用。1）吸附剂的选择：根据吸附能力强弱分为：弱吸附剂：蔗糖、淀粉中等吸附剂：碳酸钙、磷酸钙、硅胶等强吸附剂：氧化铝、活性炭一、吸附层析6吸附剂的选择根据相似相溶原则：极性强的吸附剂易吸附极性强的物质非极性的吸附剂易吸附非极性的物质。但为了便于解吸附，对于极性强的物质通常选用极性弱的吸附剂进行吸附。

一、吸附层析3、吸附剂74、洗脱剂要求：

粘度小，纯度高，稳定性好，完全洗脱下所要分离的成分,易与目标分子分离。选择：

具有较高洗脱能力的洗脱剂作为流动相。生物大分子一般选择中性盐溶液为洗脱剂。一、吸附层析羟基磷灰石

羟基磷灰石[Ca5(PO4)3OH2，简称HA]的吸附容量高，稳定性好(在T＜85℃，pH5.5-10.0均可使用)，因此在制备及纯化蛋白质、酶、核酸、病毒和其它生命物质方面得到了广泛的应用。有时有些样品如RNA、双链DNA、单链DNA和杂合型双链DNA-RNA等，经过一次HA柱层析，就能达到有效的分离。HA的Ca2+基团和生物分子表面的负电荷基团的相互反应，在用HA分离生物分子过程中起着重要作用。而HA的PO43-基团与生物分子表面的正电荷基团的相互反应，则仅起着次要的作用。使用HA作为固定相基质的注意事项：

(1)HA系干粉时，要先在蒸馏水中浸泡，使其膨胀度(水化后所占有的体积)达到2-3mL/克后，再按1∶6体积加入缓冲液悬浮，以除去细小颗粒；(2)HA悬浮液须用旋涡振荡器混合，若用磁棒或玻棒搅拌时，HA的晶体结构会被破坏；(3)忌用柠檬酸缓冲液和pH＜5.5的缓冲液。当用过的HA层析柱再生时，要先挖去顶部的一层HA，然后用一倍床体积的1mol/LNaCl溶液洗涤，接着用4倍床体积的平衡液洗涤平衡，如此处理后即可使用；(4)就操作容量来说，一般细颗粒HA比粗的大。而从分辨率比较，粗颗粒HA也没有细的好。用细颗粒HA层析时，柱子直径应大些才能达到满意的流速。

105、应用

分离纯化生物大分子一、吸附层析11二、分配层析分配层析是利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分分离的方法。分配系数是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两项溶剂中的浓度的比值。在层析条件确定后，分配系数是一常数，用K表示。12在分配层析中，通常采用一种多孔性固体支持物（如滤纸、硅藻土、纤维素等）吸着一种溶剂为固定相，这种溶剂在层析过程中始终固定在多孔支持物上。另一种与固定相溶剂互不相溶的溶剂可沿着固定相流动，称为流动相。当某溶质在流动相的带动流经固定相时，该溶质在两相之间进行连续的动态分配。二、分配层析131、纸上层析固定相：滤纸纤维的结合水流动相：与水不相混溶或部分混溶的有机溶剂二、分配层析141、纸上层析二、分配层析15三、离子交换层析

（ionexchangechromatography，IEC）原理:根据待分离物质带电性质不同的分离纯化方法。161、离子交换剂：离子交换剂由载体、电荷基团和反离子构成。

如羧甲基纤维素离子交换剂组成纤维素—O—CH2—COO-—Na+

载体电荷基团反离子三、离子交换层析17

化学原料合成：树脂类物质载体

天然材料制成：cellulosesephadexsepharose

阳离子交换剂:电荷基团（－）,反离子（＋）电荷基团阴离子交换剂:电荷基团（＋）,反离子（－）

如：DEAE-纤维素，CM-Sepharose三、离子交换层析18离子交换剂--带有电荷基团的不溶性载体-O-CH2CH2N-HCH2CH3CH2CH3Cl-载体Diethylaminoethyl(DEAE)阴离子交换剂(可吸附带负电的蛋白质)阳离子交换剂(可吸附带正电的蛋白质)19两种离子交换剂阴离子交换剂：常用二乙氨基乙基，二乙氨基乙基2-羟丙基阳离子交换剂：常用羧甲基CM—CH2COO－

磺丙基SP—C3H6SO3－DEAE－C2H4N+(C2H5)2HQAE－C2H4N+(C2H5)2CH2CH(OH)CH3三、离子交换层析20类型说明功能基反离子DEAE-SephadexA-25，A-50弱碱性阴离子交换剂二乙氨基己基氯QAE-SephadexA-25，A-50强碱性阴离子交换剂二乙氨基己基—2-羟丙基氯CM-SephadexC-25，C-50弱酸性阳离子交换剂羧甲基钠SP-SephadexC-25，C-50强酸性阳离子交换剂磺丙基钠离子交换葡聚糖21

离子交换剂的选择a.强、弱离子交换剂的选择：强型：适用的pH范围广，制备无离子水

弱型：适用的pH范围窄，分离生物大分子物质

b.阴、阳离子交换剂的选择：蛋白质的稳定性若<pI稳定，蛋白质带正电荷，用阳离子交换剂若>pI稳定，蛋白质带负电荷，用阴离子交换剂三、离子交换层析222、蛋白质的电荷性质三、离子交换层析23pH值如何影响蛋白质的电荷数24681012140系统pH+

蛋白质带正电荷

蛋白质带负电荷等电点-24

3、实验设计原理利用不同的蛋白质分子在溶液中所带电荷不同，因而与离子交换剂有不同吸附力而分离。pH6.0pI>6.0蛋白质带正电pI<6.0蛋白质带负电254、

阴离子交换剂分离蛋白质的过程平衡吸附去吸附分离结束再生+低盐高盐利用不同盐浓度将不同蛋白质洗脱下來Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-265、操作平衡→上样→平衡→洗脱→再生1）上样：上样体积不十分严格。2）洗脱:

增加溶液的离子强度

梯度洗脱法

改变溶液的pH值

3）再生：用0.5mol/LNaOH和0.5mol/LNaCl混合溶液或0.5mol/LHCl处理。三、离子交换层析27四、凝胶过滤层析

凝胶过滤（gelfiltration）又称分子筛层析（molecularsievechromatography）、排阻层析（exclusionchromatography）,是以各种多孔凝胶为固定相，利用溶液中各组分的分子量不同而进行分离的技术。281、基本原理

大分子物质不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；小分子物质可自由出入凝胶孔，流程长而后流出层析柱。29凝胶对溶质的排阻程度可用分配系数Ka表示：

Ve-VoKa=————ViVo——外水体积，层析柱内凝胶颗粒之间空隙的体积（ml）Vi——内水体积，层析柱内凝胶颗粒内部各微孔体积的总和（ml）Ve——某组分的洗脱体积，从加进层析柱到流出液中该组分出现高峰时的洗脱液体积（ml）30凝胶过滤柱色谱洗脱的三种峰Ⅰ.Ka=0时,即Ve=Vo,说明该组分分子量足够大，不进入微孔，最先流出。Ⅱ.其它组分0<Ka<1,因分子大小而改变洗脱峰的位置。Ka小的先流出，Ka大的后流出。Ⅲ.Ka=1时,即Ve=Vo+Vi，说明该组分能进入凝胶的全部内空隙，最后流出。31分配系数Ka的意义：1)可定量地衡量各组分的流出顺序。2)判断分离效果，Ka差异大，分离效果好，

Ka差异小，分离效果差。四、凝胶层析32LogMABCLogM测V测LogM=k1-k2Ve（Ve为洗脱体积）先测得几种标准蛋白质的Ve，并以其分子量对数对Ve作图得一直线，再测出待测样品的Ve，查标准曲线即可确定分子量。蛋白质的洗脱体积与其分子量有关332、凝胶的选择与处理

1)交联葡聚糖凝胶（dextrangel)

商品名:Sephadex

型号

SephadexG－10至G-200G后的数字为凝胶吸水值的10倍。数字越大，交联度越小，孔径越大，分离范围越广。四、凝胶层析34凝胶型号

颗粒大小/μm

溶胀体积/(ml/g)

分离范围（Mr）

SephadexG-10

SephadexG-15

SephadexG-25

SephadexG-50

SephadexG-75

SephadexG-100

SephadexG-150SephadexG-2004～120

4～120

50～150

50～150

40～120

40～120

40～120

40～120

2～3

2.5～3.5

4～6

9～11

12～15

15～20

20～30

20～30

小于7×102

小于1.5×103

1.0×103～5.0×103

1.5×103～3.0×1043.0×103～8.0×104

4.0×103～1.0×105

5.0×103～3.0×105

5.0×103～6.0×105

葡聚糖凝胶层析介质的有关参数

352）琼脂糖凝胶（agarosegel)

商品名:Sepharose（瑞典）;Bio-GelA(美国）依靠糖链之间的次级键维持网状结构，琼脂糖密度越大，网状结构越密集。四、凝胶层析36型号

使用范围（蛋白质的分子量）含琼脂糖（℅）

6BSepharose4B2B104～3×106105～3×107106～108

642

6BSepharoseCL4B2B

同上

同上

0.5m

Bio-GelA1.5m5m15m50m150m10～500×10310～150010～500040～15000100～500001000～150000

1086421

Sepharose及Bio-gelA型号

373）聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamidegel）

商品名为Bio-GelP,型号从Bio-GelP－2至P-300，P值越大，孔径也越大。以丙烯酰胺为单体，以甲叉双丙烯酰胺为交联剂聚合成的高分子聚合物。四、凝胶层析383、操作：1）凝胶的选择和处理根据相对分子质量范围选择相应型号的凝胶介质。将干胶悬浮于5~10倍的蒸馏水中，充分溶胀，抽气，装柱。2）柱的选择采用L/D比值高的柱子，可提高分辨率，但影响流速。四、凝胶层析393）加样体积不能过多，不超过床体积的30％，通常可在10％左右。4）洗脱洗脱液与平衡时用的buffer一致。洗速不可过快，保持恒速。5）胶的保存洗脱完毕后，凝胶柱已恢复到上柱前的状态，不必再生处理。用0.02%NaN3防腐。四、凝胶层析404、应用

1）脱盐２)生物大分子物质的分离纯化

3）分子量的测定

四、凝胶层析41

五、亲和层析(AffinityChromatography)

由吸附层析发展起来的，是从复杂混和物中纯化蛋白质的最好方法。又称：功能层析（functionchromatography）生物专一吸附（biospecificadsorption）选择层析（selectivechromatography）42

1.原理利用生物大分子间特异的亲和力来纯化生物大分子，如：抗原和抗体；酶和底物或辅酶或抑制剂；激素和受体；RNA和其互补的DNA等。五、亲和层析43

将待纯化物质的特异配体通过适当的化学反应共价的连接到载体上，待纯化的物质可被配体吸附，杂质则不被吸附，从层析柱流出，变换洗脱条件，即可将欲分离的物质洗脱下来，实现分离提纯。五、亲和层析

1、原理44+CCC配基蛋白质1.配基固相化2.亲和吸附固体载体3.解吸附452、亲和层析的母体和配基理想的基质应满足以下要求：①高度的亲水性。②极低的非特异性吸附性（惰性）。③具有足够的化学基团。④适当的多孔性。⑤较好的理化稳定性。五、亲和层析46（1）可被应用的母体：（按性能优劣排序）琼脂糖凝胶、聚丙稀酰胺凝胶、葡聚糖凝胶、纤维素。最常用的是琼脂糖，Sepharose1B到10B五、亲和层析47（2）配基的选择一对可逆结合的生物分子中与母体相偶联的一方。如抑制剂，底物，抗体，辅酶等。

优良配基须具备的条件：1）与待纯化的物质有较强的亲和力。2）具有与母体共价结合的基团。五、亲和层析48所要分离的目的产物

相应的配基

酶抗体凝集素激素底物、抑制剂、辅酶（辅因子）抗原、病毒、细胞多糖、糖蛋白、细胞受体受体、载体蛋白

目的产物与相应的配基

49（3）偶联（亲和吸附剂的制备）配基一定，改造母体1）母体活化：不同的母体活化需要不同的活化剂。常用：溴化氰（CNBr）、环氧氯丙烷、1,4-丁二醚、戊二醛、高碘酸盐、苯醌等。五、亲和层析50溴化氰法是最早使用且最常用的活化方法。如用CNBr作用于葡聚糖和琼脂糖的糖羟基512）引入连接臂（spacearm）

又称手臂（spacer）“接臂”的目的：克服影响配基与生物大分子的结合的空间障碍。“接臂”的途径：常用二胺化合物（丁二胺、乙二胺、己二胺）。目前带有各种手臂的系列载体已有商品供应。如：AH-Sepharose4B5253常用手臂542、亲和层析方法：A层析前：制备亲和层析剂

选择根据欲分离物质特性配基选择根据配基分子大小及基团特性母体B洗脱：能削弱酶和亲和吸附剂间的相互作用偶联亲和层析剂552、亲和层析方法（1）共价亲和层析（2）疏水层析（3）金属离子亲和层析（4）免疫亲和层析（5）染料亲和层析（6）凝集素亲和层析（7）分子对亲和层析563.应用1）纯化大分子物质如：纯化糖蛋白用凝集素（能可逆性地结合碳水化合物的蛋白质），Lectin-Sepharose4B2)研究酶的结构与功能：分离有生物活性与失去生物活性的蛋白质。574、疏水层析（HydrophobicInteractionChromatography,HIC）利用疏水层析介质和蛋白质分子都具有一定的疏水性质，根据被分离成分与固定相之间疏水力大小的不同而进行分离。58大多数蛋白质具有较强的亲水性，但分子内部存在一个疏水核心，欲让蛋白质与疏水性固定相结合在一起，可以靠蛋白质表面的一些疏水补丁（hydrophobicpatch），或让蛋白质发生局部变性（可逆），暴露出掩藏于分子内的疏水性残基。（1）原理:59在高盐浓度下，蛋白质发生局部可逆变性，被迫与疏水层析的固定相结合在一起，然后通过降低流动相的离子强度，即可将结合于固定相的蛋白质，按其结合力大小，依次进行解吸附。6061（2）吸附剂

亲水性（如Sepharose）基质固定相疏水性（如硅胶、树脂）配体（疏水性基团）（苯基、辛基、烷基）62产品名称载体配基生产公司苯基Sepharose4B琼脂糖凝胶珠苯基Pharmacia辛基Sepharose4B琼脂糖凝胶珠辛基Pharmacia烷基交联琼脂糖凝胶珠琼脂糖凝胶珠烷基(Cn)以色列一些商品疏水层析介质

63（3）操作1）加样：样品溶液中补加适量的盐。2）洗脱：用降低盐浓度的平衡缓冲液洗脱。3）再生：除去固定相吸附的杂质，用水或

8mol/L尿素溶液。（4）应用主要用于分离纯化大分子物质。64六、层析聚焦（Chromatofocusing）将酶等两性物质的等电点特性与离子交换层析的特点结合在一起，实现组分分离的层析技术。兼有等电聚焦电泳和离子交换层析两种方法的优点。65聚焦层析(Chromatofocusing)是在层析柱中填满多缓冲交换剂(如pH7—9)，加样后以特定的多缓冲剂滴定或淋洗时。随着缓冲液的扩展，便在层析柱中形成一个自上而下的pH梯度，而样品中各种蛋白质按各自的等电点聚焦于相应的pH区段，并随pH梯度的扩展不断下移，最后便分别从层析柱中洗出。661.离子交换剂和缓冲液体系（1）多缓冲离子交换剂（2）多缓冲溶液聚焦层析也是一种柱层析。流动相为多缓冲剂，固定相为多缓冲交换剂。

聚焦层析的缓冲液也称多聚缓冲液，是一种两性电解质缓冲液，其性质与载体两性电解质相似，由分子量不等、多种组分的多羧基多氨基脂肪族同系物组成多羧基多氨基脂肪族同系物在250nm有较大吸收，而再280nm吸收很低。在聚焦洗脱过程中最好选择280nm检测有效成分的出峰情况，否则干扰较大瑞典Pharmacia公司出售的多缓冲剂有polybuffer96和polybuffer74两种。这两种多缓冲剂分别在pH6～9和4~7范围内具有较强的缓冲能力(见图8-1);如将它们混合在一起，则较强缓冲能力的pH范围为4～9。另外，pH8.0~10.5的两性电解质(pharmalyte)也具有多缓冲剂的性能。在实践中如何选用多缓冲剂?这须根据聚焦层析的pH梯度范围来决定。

聚焦层析介质种类较少，主要以交联琼脂糖为载体，通过共价键将多氨基多羧基化合物偶联到琼脂糖凝胶载体上，这类介质具有琼脂糖介质的亲水性和大孔性的基本特征，具有两性电解质的聚焦作用和离子交换能力商品名配体

载体介质pH范围PBE94三级胺和四级胺polymerSepharose6B9~4PBE118三级胺和四级胺polymerSepharose6B11~8712.pH梯度的形成利用多缓冲离子交换剂本身带电基团的缓冲作用自动形成的。例如多元缓冲交换剂其pH可在6-9之间。使用时将其pH调到9(起始pH)。将多元缓冲液(pH6-9)的pH调至7(极限pH)来淋洗层折柱，此时在层析柱内便形成了自上而下的pH7-9的梯度。1．pH梯度溶液的形成前面提到，在离子交换层析中，pH梯度溶液的形成是靠梯度混合仪实现的。

制备pH梯度溶液例如，当使用阴离子交换剂进行层析时，制备pH值梯度溶液的方法是：

先，在梯度仪的混合室(连层析柱者)中装高pH值溶液，在另一室装低pH值极限溶液(见图8-2A)，

然后，打开层析柱的下端出口，让洗脱液连续不断地流过柱体。这时，从柱的上部到下部溶液的pH值是由低到高变化的(见图8-2A)。洗脱液则由高到低依次流出。图8-2A离子交换层析梯度形成示意图pH梯度的形成

聚焦层析介质上偶联的多氨基多羧基的有机分子具有相应的碱性和酸性离子交换基团，能与缓冲液中的H+

或OH-作用而形成pH梯度；在色谱过程中能与溶液中的某些阴离子或阳离子发生聚焦反应，聚焦在不同的区域，使物质达到分离首先，层析介质经pH较高的起始缓冲液平衡，柱内就会自动形成一个连续的pH梯度，色谱介质都会带上不同数目的负电荷当溶液中带负电荷的离子流过时就会根据各自pH不同在不同的部位发生交换聚焦，被吸附在介质上然后用pH较低的缓冲液洗脱时，被吸附的物质重新带电荷，从介质上解下来例如：当柱中装阴离子交换剂PBE94(作固定相)时，先用起始缓冲液平衡到pH9，

再用含pH6的多缓冲剂物质(作流动相)的淋洗液通过柱体，这时，多缓冲剂中酸性最强的组分（阴离子）

与碱性阴离子交换剂结合，发生中和作用。

如：基质--电荷基团+--OH-+H+Cl-

基质--电荷基团+--Cl-+H2O随着，淋洗液的不断加入，柱内每点的pH值

从高到低逐渐下降。照此处理一段时间，从层析柱顶部到底部就形成了pH6～9的梯度。随着淋洗的进行，pH梯度会逐渐向下迁移，从底部流出液的pH值却由9逐渐降至6；并最后恒定于pH=6；这时层析柱的pH梯度也就消失了。-Cl--Cl--OH-+++淋洗液++-OH-pH低高pH=6图8-2B聚焦层析梯度形成示意图2．蛋白质的行为1）蛋白质所带电荷取决于它的等电点(pI)和层析柱中的pH值。当柱中的pH值低于蛋白质的pI值时，蛋白质带正电荷，且与阴离子交换剂不结合。2）而随着洗脱剂向前移动，当蛋白质移动至环境pH值高于其pI值时，蛋白质由带正电荷变为带负电荷，并与阴离子交换剂结合。3）洗脱剂的通过，固定相中的pH值随着淋洗时间延长而变化。蛋白质周围的环境pH值再次低于pI值时，它又带正电荷，并从交换剂解吸下来。

蛋白质所带电荷取决于它的pI和层析柱的pH值pH环境

pH＜pIpH＞pIpH＜PIPro带电性+-+吸附情况不吸附吸附解吸附如此反复进行，各种蛋白质就按等电点大小不同分别被洗脱下来，从而达到分离的目的4）随着洗脱液向柱底的迁移，上述过程将反复进行，于是各种蛋白质就按各自的等电点大小，依次被洗下来，从而达到了分离的目的。5）不同蛋白质具有不同的等电点，它们在被离子交换剂结合以前，移动之距离是不同的，洗脱出来的先后次序是按等电点大小排列的（大的先，小的后）。这一过程见图8-3。

3．聚焦效应蛋白质按其等电点在pH梯度环境中进行排列的过程叫做聚焦效应。pH梯度的形成是聚焦效应的先决条件。如果一种蛋白质是加到已形成pH梯度的层析柱上时，由于洗脱液的连续流动，它将迅速地迁移到与它等电点相同的pH处。从此位置开始，其蛋白质将以缓慢的速度进行吸附、解吸附，直到pH<pI时被洗出(见图8-4)。在前蛋白质样品被洗出前，再加入第二份同种蛋白质样品时，后者将在洗脱液的作用下快速向前移动，而不被固定相吸附，直到其迁移至近似本身等电点的环境处(即前样品的缓慢迁移处)。然后两份样品以同样的速度迁移，最后同时从柱底洗出。

843.层析聚焦的操作过程（1）多缓冲离子交换剂和多缓冲溶液选择（2）形成pH梯度（3）上柱聚焦（4）洗脱（5）再生二、操作测定样品的等电点选择适当的多缓冲剂和交换剂用起始缓冲液平衡的交换剂装入柱中所需装置UV仪pH仪记录仪部分收集器泵调节起始缓冲液至梯度的上限让5~10倍体积缓冲液流过柱体加样多缓冲剂洗脱起始缓冲液重新平衡洗脱液被分离、分析柱再生调节起始缓冲液至梯度的下限样品中多缓冲剂的去除方法在待分离样品中加入固体，使蛋白质沉淀，再通过离心分离用SephadexG-25层析分离将分离的样品通过亲和层析和疏水层析分离三、应用（一）、分离蛋白质根据聚焦层析的原理，可用聚焦层析将pI值不同的蛋白质组分分离开如：①用pH梯度为9~6的聚焦层析柱可将鲸和马的肌红蛋白及碳氧血红蛋白（各2mg）混合样品分离成三个主峰（图8-6）②用pH梯度为11~8的聚焦层析柱可将细胞色素C和核糖核酸酶的混合液分离成四个主峰

聚焦层析的分辨率高，峰宽窄，且随着pH梯度间隔缩小分离效果更佳如：碳氧血红蛋白的亚组分在pH梯度为8~5的聚焦层析柱中分离效果不很理想；而在pH梯度为8~7的聚焦层析柱中可分离开鸡蛋白组分pH7~4的聚焦层析柱分离，结果能分离出多种组分用pH9~6的聚焦层析柱分离鹿肌肉水溶性蛋白质，可分离出大量蛋白质峰（二）、鉴定某些酶的性质可作为测定蛋白质等电点的方法之一七高效液相色谱概述

高效液相色谱法(highperformanceliquidchromatography,HPLC)，又称高压液相色谱法、高速液相色谱法、现代液相色谱法等，是在经典液相色谱和气相色谱的基础上发展起来的分析技术。特别适用于高沸点、不能气化或热稳定性差的有机物分离分析，在生物化学与分子生物学中的应用日益广泛。HPLC的特点

HPLC在高压下使液体通过色谱柱，在室温条件下分离混合组分，经检测器转变成电信号，由记录器描记或数据处理装置显示测定结果，具有高压、高速、高效、高灵敏度等特点。1.高压：由于HPLC是以液体作为流动相，而液体比气体通过色谱柱时所受的阻力要大得多，所以必须施加高压，一般为15-30MPa，最高可达50MPa。2.高速：由于HPLC采用了高压，使流动相液体的流速加快，一般分析周期为数分钟至数10分钟，比经典的液相柱色谱要快得多，但比GC稍慢。3.高效：由于HPLC的柱效较高(每米塔板数可达5000)，有时一根柱子可分离数十种乃至上百种组分。4.高灵敏度：采用灵敏的检测器和自动化装置，可检出10-9g乃至10-11g的物质；所需试样量很少，通常只需数十微升试样即可进行全分析。由于HPLC具有以上特点，所以70年代以来得到了迅速的发展。94分类

按溶质（样品）在两相分离过程的物理化学性质分类：亲和色谱：——亲和力吸附色谱：——吸附力离子交换色谱：——离子交换能力凝胶色谱：——分子大小而引起的体积排阻分配色谱：——分配系数95分配色谱又可分为：

正相色谱：固定相为极性，流动相为非极性。

反相色谱：固定相为非极性，流动相为极性。用的最多，约占60～70％。

固定相：硅胶填料是非极性的，官能团为烷烃。

流动相组成：常用“甲醇—H2O”。

96反相色谱中，蛋白质按其疏水性大小进行分离，极性越大疏水性越小的溶质，越不易与非极性的固定相结合，先被洗脱下来。即：随着甲醇梯度的增加而洗脱出疏水性越来越强的蛋白质。973.色谱仪组成

1）进样系统

2）输液系统

3）分离系统

4）检测系统

5）数据处理系统9899第六节电泳分离电泳（electrophoresis）：指带电粒子在电场中向着与其所带电荷性质相反的电极方向移动的过程。电泳技术是根据各种带电粒子在电场中迁移速度的不同而对物质进行分离的实验技术。100一、电泳的基本理论

1.原理:在一定pH条件下（用buffer），不同大小、形状及带电颗粒在电场中的移动速度不同（用迁移率表示），各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。

+-101迁移率与内在特性和外界条件有关内在特性：颗粒性质（净电荷量，颗粒大小、形状）外界条件：电场强度、溶液性质、支持体特性102

将带净电荷Q的粒子放入电场，受到的电引力为：

F引=EQ

在溶液中,运动粒子与溶液之间存在阻力F阻

F阻=6πrηV

当F引=F阻时EQ=6πrηVEQV=6πrη103

影响迁移率的因素：1）颗粒性质：

Q越大、r越小、形状越接近球形，v越快。2）电场强度：E越高，v越快。3）溶液性质：

pH值：离pI越远，v越快。（用buffer保持恒定）离子强度：离子强度越高，v越低。原因：离子氛（ionicatmosphere）。通常，缓冲液离子强度在0.02-0.2之间。4）电渗：在电场中，液体对于固体支持物的相对移动应避免用高电渗物质作支持介质。104自由界面电泳：又称移动界面电泳（movingboundaryelectrophoresis,MBEP），指在没有支持介质的溶液中进行的电泳。区带电泳:（zoneelectrophoresis,ZEP）指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。支持介质的作用:防止电泳过程中的对流和扩散。2.电泳的分类105按支持介质种类的不同，区带电泳可分为：①纸电泳：用滤纸作为支持介质，多用于核苷酸的定性定量分析。②醋酸纤维素薄膜电泳：医学上，常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋白，优点是简便迅速，便于保存照相，比纸电泳分辨率高。以上两种类型的电泳，由于介质的孔径度大，没有分子筛效应，主要靠被分离物的电荷多少进行分离。

106按支持介质种类的不同，区带电泳可分为：③琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。④聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。分辨率较高。聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质。107⑤薄层电泳：将支持体与缓冲液调制成适当厚度的薄层而进行电泳的技术。常用的支持体有淀粉、纤维素、硅胶、琼脂等。淀粉板薄层电泳广泛用于蛋白质、核酸、酶等的分离。108

3.电泳常用设备

（1）电泳仪：为电泳提供稳定直流电源的装置。

常压电泳仪（600V）

高压电泳仪（3000V）

超高压电泳仪（30000V～50000V）（2）电泳槽：

自由界面电泳槽管状电泳槽板状电泳槽（3）附属设备：

109二、纸电泳110三、薄层电泳111四、聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。

112

1、原理

聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（acrylamide，简称Acr）和交联剂N，N’-甲叉双丙烯酰胺（methylanebisacrylamide，简称Bis）在催化剂和加速剂作用下聚合的。113CH2=CHC=ONH2CH2=CH

C=ONHCH2NHC=OCH2=CH-CH2-CH-[CH2-CH-]nCH2-CH-C=OC=ONH2NHCH2NHC=O-CH2-CH-[CH2-CH-]nCH2-CH-C=OC=ONHNH2丙烯酰胺N,N’-甲叉双丙烯酰胺聚丙烯酰胺114

聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：1）化学催化系统：AP-TEMED

催化剂：过硫酸铵（ammoniumpersulfate，AP）加速剂：TEMED（N，N，N’，N’-四甲基乙二胺）2）光催化系统：核黄素－光－（TEMED）催化剂:核黄素（维生素B2）

引发剂:光

TEMED的存在，可加速聚合。.115聚丙烯酰胺凝胶：丙烯酰胺＋N,N’－甲叉双丙烯酰胺聚合而成聚丙烯酰胺凝胶有下列优点：(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好。(2)化学性能稳定，与被分离物不发生化学反应。(3)对pH和温度变化较稳定。(4)几乎无电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好。(5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g。(6)凝胶孔径可通过选择单体及交联剂的浓度调节。(7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体，因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。PAGE应用范围广，可用于蛋白质、酶、核酸等生物分子的分离、定性、定量及少量的制备，还可测定相对分子质量、等电点等。117凝胶的机械强度、弹性和透明度粘着度取决于凝胶总浓度（T）和交联度（C）。

T=

C=

凝胶浓度越大（小），孔径越小（大），可分离分子量较小（大）的颗粒。

Acr与Bis的重量比应在30左右。

凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系Acr（g）+Bis（g）V（ml）X100%Acr（g）+Bis（g）Bis（g）X100%118样品分子量（Da）适宜的凝胶浓度（％）蛋白质<1041～4×1044×104～1×105105～5×105>5×10520～3015～2010～155～102～5聚丙烯酰胺凝胶浓度参考表1192.分离效应

PAGE根据其有无浓缩效应，分为：连续电泳（continuouselectrophoresis）采用相同孔径的凝胶和相同的缓冲系统不连续电泳（discontinuouselectrophoresis）

采用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系电荷效应不连续PAGE分子筛效应浓缩效应

连续PAGE1201）电荷效应:

分离胶中，蛋白质表面净电荷不同，迁移率不同。2）分子筛效应：大小和形状不同的样品分子通过一定孔径的分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。3）浓缩效应：使样品在浓缩胶中被浓缩成一条窄带，然后再进入分离胶进行分离。121不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳系统的不连续性表现在以下几个方面：

1.凝胶由上、下两层凝胶组成，两层凝胶的孔径不同，上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。

2.缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl缓冲液，而分离胶为pH8.9的Tris-HCl缓冲液。

3.在电场中形成不连续的电位梯度。因此，在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即样品的浓缩效应，凝胶的分子筛效应和电荷效应，提高了分辨率。8.38.38.96.71.样品浓缩效应(1)凝胶孔径的不连续性：上述3层凝胶中，样品胶及浓缩胶为大孔胶；分离胶为小孔胶。在电场作用下，样品颗粒在大孔胶中泳动的阻力小，移动速度快；当进入小孔胶时，受到的阻力大，移动速度减慢。因而在两层凝胶交界处，样品迁移受阻而压缩成很窄的区带。(2)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性：在三层凝胶中均有三羟甲基氨基甲烷(简称Tris)及HCl。Tris的作用是维持溶液的电中性及pH值，是缓冲配对离子。HCl在任何pH溶液中均易解离出(Cl-)，在电场中迁移率快，走在最前面称为快离子。在电极缓冲液中，除有Tris外，还有甘氨酸(glycine)，其pI=6.0，在pH8.3的电极缓冲液中，易解离出甘氨酸根(NH2CH2COO-)，而在pH6.7的凝胶缓冲体系中，甘氨酸解离度仅有0.1%-1%，因而在电场中迁移很慢，称为慢离子。血清中大多数蛋白质pI在5.0左右，在pH6.7或8.3时均带负电荷向正极移动，迁移率介于快离子与慢离子之间，于是蛋白质就在快、慢离子形成的界面处，被浓缩成为极窄的区带。当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质；因此Cl-及NH2CH2COO-沿着离子界面继续前进。蛋白质分子由于相对分子质量大，被留在后面，逐渐分成多个区带。(3)电位梯度的不连续性：电泳开始后，快离子的快速移动会在其后形成一个离子强度很低的低电导区，使局部电位梯度增高，将蛋白质浓缩成狭窄的区带。2.分子筛效应

大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。蛋白质进入pH8.9的同一孔径的分离胶后，分子小且为球形的蛋白质分子所受阻力小，移动快，走在前面；反之，则阻力大，移动慢，走在后面，从而通过凝胶的分子筛作用将各种蛋白质分成各自的区带。这种分子筛效应不同于柱层析中的分子筛效应，后者是大分子先从凝胶颗粒间的缝隙流出，小分子后流出。3.电荷效应

在pH8.9的分离胶中，各种带净电荷不同的蛋白质有不同的迁移率。净电荷多，则迁移快；反之，则慢。因此，各种蛋白质按电荷多少、相对分子质量及形状，以一定顺序排成一个个区带，因而称为区带电泳。目前，PAGE连续体系应用也很广，虽然电泳过程中无浓缩效应，但利用分子筛及电荷效应也可使样品得到较好的分离，加之在温和的pH条件下，不致使蛋白质、酶、核酸等活性物质变性失活，也显示了它的优越性。23九月2023SWAU23九月2023SWAU23九月2023SWAU23九月2023SWAU128聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图

(A为正面,B为剖面)

(1)样品缓冲液pH6.7(2)浓缩胶pH6.7

(3)分离胶pH8.9(4)电极缓冲液pH8.3

垂直板式电泳槽上电极缓冲液下电极缓冲液样品槽上样器阴极阳极电泳方向聚丙烯酰胺凝胶板SDS电泳电泳条带132五、SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳

十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodiumdodecylsulphate-polyacrylamidegelelectrophoresis,SDS-PAGE）简称SDS－PAGE。是目前测定蛋白质亚基相对分子量（relativemolecularmass,Mr）的一种最好的办法。133

SDSseparatesproteinsbyMW1341.原理：

SDS是一种阴离子去污剂，带有大量负电荷，与蛋白质结合后使蛋白质所带负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异。

SDS破坏蛋白质氢键、疏水键，巯基乙醇使二硫键打开，引起蛋白质构象改变，使蛋白质－SDS复合物形状近似椭圆形，短轴相同（1.8nm），长轴与蛋白质分子量成正比。因此，蛋白质—SDS复合物(SDS-denaturedprotein)在凝胶中的迁移率不受蛋白质原有电荷和形状的影响，只与椭圆棒长度（蛋白质分子量）有关。135两者关系：蛋白质的迁移率与分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMw=K-bXMw：分子量；X：迁移率；k、b均为常数将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据其相对迁移率即可在标准曲线上求得分子量。1362.操作：（SDS及PAGE，即变性及非变性）1）制胶:

（变性：buffer中加0.4%SDS）

a.分离胶：根据待分离样品的分子大小选择一定浓度的分离胶（查表），配制分离胶溶液：

Acr:Bis=29:1，分离胶buffer,TEMED,AP,水迅速倒胶，加水使液面平坦，室温0.5h聚合完全。

b.浓缩胶：用浓缩胶buffer。插上梳子。1372）样品制备：

a.PAGE:样品＋样品缓冲液（蔗糖或甘油＋指示剂溴酚蓝）

b.SDS:样品＋样品缓冲液（SDS，甘油，巯基乙醇，溴酚蓝），煮沸2~5min，以除去亚稳态聚合。3）加样及电泳：

SDS:电极buffer中加0.1%SDS，溴酚蓝距下端1cm时停止电泳。1384）固定及染色a.固定：将凝胶浸于7％乙酸或12.5％三氯乙酸中固定蛋白质组分。b.染色：

考马斯亮蓝染色法

银染法（灵敏度比前者高100倍）其它的染色方法：氨基黑、阿尔辛蓝，过碘酸－Schiff试剂（糖蛋白）。139六、等电聚焦(isoelectricfocusing，IEF)

利用蛋白质具有不同等电点的特性，以聚丙烯酰胺为电泳支持物，在其中加入载体两性电解质（商品名：Ampholine，一种含有各种连续

pI的小分子混合物）的电泳方法称聚丙烯酰胺等电聚焦电泳（IEF）。1401.原理

两性电解质载体在电场作用下，按各自pI形成从阳极到阴极逐渐增加的平滑和连续的pH梯度。蛋白质在此pH梯度凝胶中泳动，当迁移至pH值等于pI处时不再泳动，被浓缩成狭窄的区带。141两性电解质载体(carrierampholytes)(1)易溶于水，有足够的缓冲能力——以便保持稳定的pH梯度。(2)导电性能好——以保持电场强度的均匀性。(3)分子量小——电泳后易分离除去。(4)化学组成不同于蛋白质——不干扰测定。142等电聚焦电泳1432.操作：

1）凝胶配制：凝胶浓度T为5％~7.5％（C=3%

左右）

2）加样：任意位置

1443）电泳：阳极：磷酸溶液电极溶液阴极：NaOH溶液只有在凝胶两端给予高电压（600V）时，才能获得较好的分辨率。而高电压的维持需要有效的凝胶冷却系统。4）固定及染色：TCA固定，考马斯亮蓝染色。1455）等电点测定：

Marker与未知样品同时电泳染色后，以pH值为纵轴，距阴极距离为横轴，做pH梯度标准曲线，据未知蛋白迁移距离可推知pI。IEF测定蛋白质pI23九月2023SWAU等电聚焦的优点是：①、有很高的分辨率，可将等电点相差0.01～0.02PH单位的蛋白质分开；②、一般电泳由于受扩散作用的影响，随着时间和所走距离加长，区带越走越宽，而电聚焦能抵消扩散作用，使区带越走越窄；③、由于这种电聚焦作用，不管样品加在什么部位，都可聚焦到其等电点处，很稀的样品也可进行分离；④、可直接测出蛋白质的等电点，其精确度可达0.01PH单位。等电聚焦电泳也有缺点，一、是电聚焦要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋白质可能发生沉淀，二、是样品中的成分必需停留于其等电点，不适用于在等电点时发生沉淀或变性的蛋白质。1473.应用：蛋白质的分离纯化测等电点七、聚丙烯酰胺凝胶双向电泳原理双向PAGE电泳是由两种类型的PAGE组合而成。样品经第一向电泳分离后，再以垂直它的方向进行第二向电泳。如这二向电泳体系pH及凝胶浓度完全相同，则电泳后样品中不同组分的斑点基本上呈对角线分布，对提高分辨率作用不大。1975年，O’Farrell等人根据不同生物分子间等电点及相对分子质量不同的特点，建立了以第一向为IEF，第二向为SDS-PAGE的双向分离技术，简称为IEF/SDS；基本原理与IEF，SDS完全相同。一般第一向IEF-AGE用超薄水平板，电泳结束后切取所需泳道用于第二向电泳，或在1mm内径的毛细管中进行第一向IEF，取出胶条用于第二向电泳。第一向电泳的方法同IEF-PAGE，只是制胶时要加入2%两性电解质和6mol/L尿素。第二向电泳时，先将SDS-PAG灌在垂直玻璃板之间，上部留2cm左右空间，待聚合后，将第一向胶条转移到第二向胶之上，用载玻片将胶条轻轻压直，加3μL1%溴酚兰指示剂，用1%的琼脂糖(用电极缓冲液配制)密封胶条，琼脂糖凝固后即可电泳。待溴酚兰将至凝胶板下方边缘时，停止电泳。第二向电泳时，用梯度混合器将凝胶制成7.5%-15%的浓度梯度，可以提高电泳的分辨率。目前，已有5，000余种蛋白质分采用IEF/SDS得到很好的分离，其高分辨率是各种类型单向PAGE及其他双向PAGE所无法比拟的。因此，IEF/SDS双向电泳已成为当前分子生物学领域内常用的实验技术，可广泛用于生物大分子如蛋白质，核酸酶解片段及核糖体蛋白质的分离和精细分析，是蛋白质组学的基本方法。随着该技术的不断改进与发展，其应用范围将更加广泛。然而，此技术对某些碱性蛋白质的分离却有其局限性，因在第一向IEF的电泳体系中，含有高浓度的尿素，它的存在会使碱性区的pH梯度变得很窄而且不稳定，可使碱性蛋白质难以进入凝胶中或者易泳出凝胶外。因此，对碱性蛋白质的分离分析应采用其他方法。

双向凝胶电泳two-dimensionalelectrophoresis

选出特定的斑点，可用于质谱法测序八高效毛细管电泳

基本原理

高效毛细管电泳(highperformancecapillaryelectrophoresis,HPCE)和一般电泳法的区别在于使用毛细管柱。在熔融石英毛细管内壁覆盖一层硅氧基(Si-O-)阴离子，由于吸引了溶液中的阳离子，由此在毛细管内壁形成表面带阴离子的双电层。层外缘扩散层中富集的阳离子被电场阴极吸引导致溶液向阴极的流动，这种效应称为电渗(electroosmosis)。电渗流的速度ueo和电场强度E成正比，23九月2023SWAU电渗流的方向与电场方向一致。不同组分受到的作用力有差别的，正离子受到相同方向的电场力和电渗流的推动，前进速率较快；负离子受到两种力的作用但方向相反，电渗流的作用大于电场力，所以负离子也是向负极运动但运动速率最慢；不带电荷的组分虽然不受电场力的作用，但强大的电渗流推动着它从正极向负极运动。23九月2023SWAU所以毛细血管中的样品中各组分，不管是否带有电荷，也不管带何种电荷，都会从正极向负极移动，迁移速率按从大到小排列顺序是：正离子最大，负离子最小，中性分子居中。经过一定时间的电泳，各种组分会实现有效的分离。如果把单位电场强度下离子在一定的温度下在介质中迁移的速率称作淌度的话，那么毛细血管电泳实质上是高压电场为驱动力，以毛细管为分离管道，依据样品中以各种组分之间淌度和分配行为上的差别而实现分离的一类液相分离技术，兼有电泳和高效液相色谱两类分离技术原理。毛细管电泳和一般的电泳的区别是可以分离各种成分，同时在普通电泳中起破坏作用的电渗流在毛细血管电泳中却变成了有效的驱动力之一。毛细血管电泳与高效液相色谱的区别在于用高压电源取代了高压泵，改善了流动相在毛细管中的流型，用塞式流型代替了分析柱中的抛物线流型，使得各种组分分峰宽变窄，提高了分辨率HPCE的毛细管容易冷却，故可以使用20-30KV的高电压，由于管内径只有25-100μm，无涡流扩散，使传质阻抗趋于零，因此，有很高的分辨率。电解质液由毛细管阳极端进入毛细管，携带被分离的组分可以从毛细管阴极端流入检测器的比色池，电泳过程与结果分析均容易自动化。因此HPCE已成为效率极高的现代分析仪器，在生物化学和分子生物学中得到日益广泛的应用。分离类型及应用

1.毛细管区带电泳

毛细管区带电泳法(capillaryzoneelectrophoresis,CZE)的分离基于组分淌度的区别，一般毛细管内壁带负电荷。电渗流从阳极移动至阴极。当被分离组分从毛细管一端引入后，各族分在电场力和电渗流的双重作用下以恒定但不同的速度向另一端迁移，经过一定时间以后，被分离成若干谱带。流出顺序是阴离子＜中性分子＜阳离子。若毛细管内壁涂上一层阳离子表面吸附剂，则极性颠倒，流出顺序是阳离子＜中性分子＜阴离子。毛细管区带电泳具有分离方便、快速、样品用量小的特点，在无机离子、有机物、氨基酸、蛋白质及各种生物样品的测试中有着广泛的应用。2.胶束电动毛细管色谱

CZE主要用于分析带电荷的离子，对中性分子的测试主要是依靠电渗的作用，分离比较困难。此时可应用胶束电动毛细管色谱(micellarelectrokineticcapillarychromatography,MECC)进行分离分析。MECC是在缓冲溶液中加入表面活性剂，当表面活性剂浓度超过临界胶束浓度时，则形成荷电胶束。而当无胶束存在时，所