第二章 有机溶剂沉淀 结晶与重结晶 超临界流体萃取技术

四、有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法介绍在蛋白质等生物大分子的水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，能显著降低蛋白质等生物大分子的溶解度，使其沉淀析出。不同蛋白质沉淀时所需有机溶剂的浓度不同，因此调节有机溶剂的浓度，可以使混合物中的蛋白质分段析出，达到分离纯化的目的。不仅适于蛋白质的分离纯化，还常用于酶、核酸、多糖等的分离纯化。有机溶剂沉淀法的优缺点(1)优点：①乙醇等有机溶剂易挥发除去，不会残留于成品中，产品更纯净；②有机溶剂密度低，沉淀物与母液间的密度差较大，分离容易，适于用离心分离收集沉淀物。(2)缺点：①采用大量有机溶剂，成本较高。为节省用量，通常将蛋白质溶液适当浓缩，并回收溶剂。②有机溶剂易燃易爆，工业生产上车间和设备都应有防护措施。常用于生物大分子沉淀的有机溶剂甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮等，其中乙醇是工业上最常用的根据工业生产的实际情况，因为原材料如中药材体积大，若用乙醇以外的有机溶剂提取，用量多、损耗大、成本高，且有些有机溶剂不利于安全生产。所以用乙醇做提取精制溶剂比较合适。乙醇沉淀法

在浓缩后的水提液中，加入一定量的乙醇，使含醇量达到80%以上时，则难溶于高浓度乙醇的成分如蛋白质、淀粉、树胶、黏液质等从溶液中沉淀析出，经滤过即可除去。同样，在乙醇提取液中加入一定量的水，也会使叶绿素、树脂等亲脂性成分沉淀析出。分类先以水为溶剂提取原材料有效成分再用不同浓度的乙醇沉淀去除提取液中杂质的方法，叫水提醇沉法。先以适宜浓度的乙醇提取原材料成分，再用水去除提取液中杂质的方法叫醇提水沉法。水提醇沉法工艺原理根据原材料中各种成分在水和乙醇中的溶解性，通过水和不同浓度的乙醇交替处理，可保留有效成分，去除杂质（包括淀粉、粘液质、油脂、脂溶性色素、树脂、树胶等）。通常认为，料液中含醇量达到50%~60%时，可去除淀粉等杂质，当含醇量达75%以上时，除鞣质、色素外大部分杂质均可沉淀去除，当含醇量达到85%以上时，鞣质、色素也可去除。水提醇沉法工艺操作要点该方法是将原材料如中药材先用水提取，再将提取液浓缩后，加入适量乙醇，使含醇量达到所需浓度，搅拌一定时间，静置冷藏，待沉淀完全沉降后分离去除沉淀，最后制得澄清的药液。水提醇沉工艺流程中药粗粉加水浸提浓缩提取液把浓缩液倒入醇沉罐浓缩液加入乙醇使达到要求含醇量搅拌规定时间静置冷藏一定时间进入过滤工序分离沉淀得到已去除杂质的澄清药液操作时应注意问题(1)药液的浓缩：水提液应经浓缩后再加乙醇处理，这样可减少乙醇的用量，使沉淀完全。浓缩程度要适宜，浓度要是太大过滤的时候就容易造成成分流失。(2)加醇方式：通常可分两种方式，一种是分次醇沉，即第一次醇沉完后先回收乙醇，然后再第二次加入所需浓度的乙醇量进行二次醇沉，这样分次醇沉有利于除去杂质，减少杂质对有效成分的包裹一起沉出而出现损失；另一种是梯度递增法醇沉，即逐步提高乙醇浓度，最后才回收乙醇，其操作方便，但乙醇用量大。操作时应注意问题不管用何种加醇方式，操作时皆应将乙醇慢慢的加入到浓缩药液中，边加边搅拌，使含醇量逐步提高，杂质慢慢分级沉出。(3)冷藏与处理：加乙醇时药液的温度不能太高，加至所需含醇量后，将容器口盖严，以防止乙醇挥发。待含醇药液慢慢降至室温后，再移至冷库中，于5℃~10℃下静置12~24小时。待提取液充分静置后，进入过滤工序。醇提水沉法工艺原理指先以适宜浓度的乙醇提取有效成分，再用水除去提取液中杂质的方法。其原理与操作大致与水醇法相同。适用于蛋白质、粘液质、多糖等杂质较多的原材料的提取和精制，使这些杂质不易被醇提出。但由于先用乙醇提取，树脂、油脂、色素等杂质可溶于乙醇而被提出，故将醇提取液回收乙醇后，再加水搅拌，树脂、油脂、色素等杂质就可沉淀。静置冷藏一定时间，待这些杂质完全沉降后滤过去除。醇提水沉工艺流程中药粗粉加醇浸提得到含有效成分和杂质的醇提取液回收提取液中的乙醇至无醇味回收完乙醇的提取液再加水搅拌、静置冷藏进入过滤工序分离沉淀得到已去除杂质的澄清药液乙醇沉淀法常用到的公式

无论是水提醇沉还是醇提水沉，都是利用乙醇的浓度变化来使杂质析出沉淀。在调药液的含醇量达某种浓度时，只能将计算量的乙醇加入到药液中，而用酒精计直接在含醇的药液中测量的方法是不正确的。分次醇沉时，每次需达到某种含醇量，其加醇量可用下式计算：C1X=C2(V+X)C1为浓乙醇的浓度，C2为所需达到的乙醇浓度，X为需加入浓乙醇的体积，V为浓缩药液的体积。求X。公式应用与实践1：现有黄芪药材2000克，加水煎煮三次，每次1.5小时，合并各次煎煮液，滤过，浓缩，得提取液500升。然后进行分次醇沉处理除杂二次。第一次醇沉，需乙醇浓度达到75%，回收乙醇，第二次醇沉浓度为85%，问两次醇沉各需加多少95%的浓乙醇？请列举几种常见的天然产物（至少5种），并写出其来源、功效及应用领域。公式应用与实践1：第一次醇沉根据稀释公式得：95%X1=

75%（500+X1）解得X1=1875升第二次醇沉根据稀释公式得：95%X2=

85%（500+X2）解得X2=4250升公式应用与实践2：

现有黄芪药材2000克，加水煎煮三次，每次1.5小时，合并各次煎煮液，滤过，浓缩，得提取液500升。然后进行梯度递增法醇沉处理除杂二次。第一次醇沉，需乙醇浓度达到75%，第二次为85%，问两次醇沉各需加多少95%的浓乙醇？公式应用与实践2：

第一次醇沉要求浓度达到75%：95%X1=75%（500+X1）第二次醇沉要求浓度达到85%：95%X2+75%×（500+1875）=85%×（500+1875+X2）解得：X1=1875X2=2375在实际生产中，更为常用的是分次醇沉，即第一次醇沉使药液含醇浓度达到C1，然后回收加入药液的乙醇，再进行第二次醇沉，但是为了减少浪费，生产上并不是把回收的乙醇舍弃不用而去用新的浓乙醇进行二次醇沉，实际的情况是：进行第二次醇沉时，常先把回收的乙醇加入药液来沉淀杂质，如果回收乙醇全加入药液还是达不到我们想要的二次醇沉浓度C2时，再用新的浓乙醇来补足。那么需要补足的浓乙醇是多少呢？我们来推导一下：二次醇沉所需乙醇浓度达到：C2,二次醇沉浓度达标后：溶液的总体积=药液体积+加入回收乙醇的体积+补足的浓乙醇的体积溶液总体积药液体积V2回收乙醇体积V1补加浓乙醇体积X设二次醇沉需要达到浓度为C2，回收乙醇浓度为C1，浓乙醇浓度为C3，加入回收乙醇后药液达到浓度为C4。则根据稀释公式有：①C1V1=C4(V1+V2)②C2(V1+V2+X)=C4(V1+V2)+C3X根据以上两个公式求出补足浓乙醇的体积X公式应用与实践3：

现有黄芪药材2000克，加水煎煮三次，每次1.5小时，合并各次煎煮液，滤过，浓缩，得提取药液500升。然后进行分次醇沉处理二次。第一次醇沉，需乙醇浓度达到75%，回收乙醇，第二次醇沉要求乙醇浓度达到85%，做法是先加入浓度为90%的回收乙醇5000升，在用纯乙醇补足，问需补足95%的浓乙醇多少升？公式应用与实践3：

二次醇沉时根据稀释公式得：90%×5000=C4(5000+500)85%(5000+500+X)=C4(5000+500)+95%X

解得X=?多糖的分离—水提醇沉法水提醇沉法是常用的多糖提取工艺。它是利用多糖溶于水或酸、碱、盐溶液而不溶于醇、醚、丙酮等有机溶剂的特点，从不同材料中进行提取。提取时一般先将原料物质脱脂与脱游离色素，然后用水或稀酸、稀碱或稀盐溶液进行提取，提取液经浓缩后即以数倍的甲醇或乙醇沉淀析出，得粗多糖。灵芝多糖的提取灵芝多糖是从灵芝中提取的一种内源活性物质，其所含的化学成分能够显著提高吞噬细胞的吞噬能力，增强体液免疫和细胞免疫功能，还能提高红细胞中超氧化物歧化酶的活性，对人体具有显著的抗肿瘤、抗癌作用，是现代人理想的保健食品。灵芝多糖的开发与应用具有广阔的空间。从灵芝子实体中提取多糖，一般采用水提醇沉法，工艺流程如下：五、结晶与重结晶结晶概述一般地说，天然产物化学成分在常温下多半是固体的物质，结晶是提纯固体化合物的一种重要方法，它适用于产品与杂质性质差别较大，产品中杂质含量小于5%的体系。鉴定天然产物化学成分，研究其化学结构，必须首先将天然产物成分制备成单体纯品。一旦获得结晶，就能有效地进一步精制成为单体纯品。因此，求得结晶并制备成单体纯品，就成为鉴定天然产物成分、研究其分子结构重要的一步。结晶原理固体有机物在溶剂中的溶解度与温度密切相关。一般是随着温度升高溶解度增大。若把固体物质溶解在热的溶剂中达到饱和，冷却时由于溶解度降低，溶液变成过饱和而析出结晶。利用溶剂对被提纯物质及杂质的溶解度不同，使被提纯物质从过饱和溶液中析出。让杂质全部或大部分留在溶液中，从而达到提纯的目的。结晶法特性应用结晶法提纯有机化合物是利用要提纯分离的化合物与其他化合物在有机溶剂中的溶解度差异及其与温度的依赖关系不同，使要提纯分离的化合物从其粗品混合物中分离出来。结晶法分离精制的关键是正确选择溶剂和结晶的条件。结晶形成的条件(1)

物质特性形成晶体的先决条件。分子越大越难结晶。多糖、蛋白质、核酸和酶等生物大分子形成晶体就困难些，其中一些结构复杂、对称性不好的核酸、蛋白质和酶等，迄今仍未获得晶体。(2)

溶质的纯度溶质要形成晶体，必须要有一定的纯度。杂质含量越低则溶质的纯度就越高，这样就有利于结晶的形成和生长。溶质的纯度达到什么样的要求才能形成结晶要依不同的溶质而定。多数蛋白质和酶的纯度必须达到50%时才能结晶。结晶形成的条件(3)合适的温度和时间一般温度低些较好，有时在室温下不能结晶时，可以放置在冰箱或阴凉处。而且结晶的形成常需要较长时间，有时需要放置3-5天或更长时间。(4)合适的溶剂条件有时有效成分含量很高，因溶剂选择不当，也得不到结晶；有时含量不高，因选择了合适的溶剂，也能得到结晶，因此合适的溶剂很重要。结晶溶液中溶剂的选择(一)

选择结晶溶剂的原则不能与被提纯物质有化学反应，不影响生物分子活性易于用溶解度差异或温度影响除去杂质其他考虑因素：操作要方便、安全、回收及成本结晶溶液中溶剂的选择溶剂的选择先通过查阅文献，参考同类型化合物的一般溶解性质和结晶条件。如果在文献中找不到合适的溶剂，可根据要结晶化合物的极性大小，利用相似相溶的溶解度规则，通过实验选择溶剂。实验时应同时选用几种溶剂进行比较。常采用试管筛选法选择结晶溶剂其方法是：取0.1g的产物放入一支试管中，滴入1mL溶剂，震荡下观察产物是否溶解，若不加热很快溶解，说明产物在此溶剂中溶解度太大，不适合做此产物的结晶溶剂；若加热至沸腾还不溶解，可补加溶剂（每次0.5mL），再加热至沸腾后观察，当溶剂量大于4mL，产物仍不溶解，则说明此溶剂也不适宜，如所选溶剂能在1-4mL溶剂沸腾的情况下使产物全部溶解，并在冷却后能析出较多晶体，说明此溶剂适合作为此产物结晶溶剂。判断标准：在沸腾下试样能全溶于1～4mL溶剂，同时冷却后有较多的结晶析出。重结晶法当第一次结晶所得晶体纯度不够（粗结晶）,杂质含量较多时,再次结晶,可得到较纯的产品,这就是重结晶。重结晶时可选用对结晶物比较难溶而对杂质较为易溶的溶剂和结晶条件,以利于除杂。必要时可使用混合溶剂和利用温度差等其他方法和条件。第四节超临界流体萃取技术在天然产物提取中的应用超临界流体的定义任何一种物质都存在三种状态：气态、液态和固态三态成平衡态共存的点叫三相点。液、气两态成平衡状态的点叫临界点。在临界点时的温度（T）和压力（p）称为临界温度和临界压力。超临界