高效液相色谱法测定山核桃树叶中球松素查耳酮的含量

高效液相色谱法测定山核桃树叶中球松素查耳酮的含量

山核桃是核桃科的一种山核桃植物。主要分布在浙江和安徽交界处的天力地区，特别是临安地区和彰化，具有明显的区域分布特征。山核桃具有广泛的药理作用,山核桃树皮具有清热解毒、抗菌消炎、镇痛、抗氧化、抗肿瘤的作用,山核桃外果皮具有抗炎镇痛、抑菌消炎的作用,山核桃叶片提取物有很好的抑菌作用,对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、酵母菌、黄曲霉菌、青霉菌和黑曲霉菌均有效。本实验室的前期研究发现山核桃叶提取物有抑制SGC-7901细胞增殖和诱导该肿瘤细胞凋亡的作用。因此,笔者经过对山核桃叶提取物进行分离,并首次从中得到球松素查儿酮(DHMC)。目前有关DHMC药理作用的研究很少,仅少量文献报道DHMC具有选择性抗利什曼原虫的作用,经过进一步研究发现,DHMC不仅对肿瘤细胞有较好的抑制作用,而且还具有抑制血管平滑肌细胞增殖、迁移及舒张血管等作用,可用于进一步开发防治动脉粥样硬化等心血管疾病的药物。目前已报道的含有DHMC的物质很少,且含量不高。本试验建立了HPLC测定山核桃树叶中DHMC含量的方法,为以后进一步开发DHMC的药用价值提供参考。1超声清洗器仪器:Dionex高效液相色谱仪(美国戴安公司)、万分之一精密电子天平(AR2130OhausCorp.PineBrook,NJ,USA)、KQ-3200DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司,功率(150W,频率40kHz)。试药:色谱级甲醇(临海市浙东特种试剂厂)、甲醇(杭州大方化学试剂厂)、水为双蒸水;山核桃叶(采自浙江临安,经浙江中医药大学陈锡林副教授鉴定为山核桃(CaryacathayensisSarg.)的树叶;对照品:DHMC(实验室自制,经NMR鉴定其结构,HPLC峰面积归一法检测含量为99.4%)。2方法和结果2.1溶液制备2.1.1山核桃叶供试品溶液的制备取适量山核桃叶粉碎,过40目筛,称取粉末约0.25g,精密称定,置于25ml容量瓶中,精密加入25ml甲醇,称定重量,超声处理30min,取出待冷却后,再次称定重量,用溶剂补足减失重量,取续滤液0.5ml,定容至10ml容量瓶中,摇匀,过0.45μm滤膜,即得山核桃叶供试品溶液。2.1.2对照品贮备溶液的制备精密称取减压干燥的DHMC对照品5mg,置10ml容量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得0.5mg/ml的对照品贮备溶液。2.1.3对照品溶液的制备精密量取对照品贮备液2.0ml,置50ml容量瓶中,加甲醇稀释至刻度,从中吸取5ml,用甲醇定容至25ml,摇匀,即得0.004mg/ml的对照品溶液。2.2dhmc的测定色谱柱为KromasilC18(250mm×4.6mm,5μm),流动相为甲醇-水(65∶35,V/V),流速为1.0ml/min,检测波长为342nm,柱温为30℃,进样量为10μl。在此条件下DHMC达到基线分离。结果见图1。2.3方法研究2.3.1dhmc进样量的线性关系精密吸取“2.1.2”项下的对照品贮备液1ml,置50ml容量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,分别精密吸取2、4、6、8、10μl,注入色谱仪进行测定,记录色谱图,以对照品进样量为横坐标(X),色谱峰面积为纵坐标(Y),求得回归方程为:Y=7.8868X-0.0409(r=0.9996)。结果表明,DHMC进样量在0.02~0.10μg范围内呈良好的线性关系。标准曲线见图2。2.3.2色谱峰面积的测定精密吸取0.004mg/mlDHMC对照品溶液10μl,注入色谱仪,重复进样6次,测定DHMC的色谱峰面积值,求得峰面积的RSD为1.1%(n=6)。2.3.3进样峰面积测定精密吸取“2.1.1”项下供试品溶液10μl,注入色谱仪,按0、1、2、3、4、5h间隔进样,测得DHMC的色谱峰面积,求得峰面积的RSD为0.9%(n=6)。结果表明,供试品溶液在室温条件下5h内基本稳定。2.3.4dhmc重现性测定取同一批药材,按“2.1.1”项下的方法平行制备6份供试品溶液并依法测定DHMC的色谱峰面积,求得峰面积RSD为0.9%(n=6),结果表明本法重现性良好。2.3.5加样回收率试验取已知DHMC含量的山核桃叶粉碎,过40目筛,称取药材粉末约0.125g,精密称定,研细,共称取6份,分别精密加入对照品贮备液(0.5mg/ml)1.6、1.6、2.0、2.0、2.4、2.4ml,再按“2.1.1”项下的方法制备供试品溶液,并依法测定,记录色谱峰面积,按外标法计算出DHMC的回收率分别为99.47%、99.71%、102.5%、101.4%、104.3%、102.3%,平均回收率为101.6%,RSD=1.8%(n=6)。2.4dhmc含量测定取“2.1.3”项下的对照品溶液和“2.1.1”项下的山核桃叶供试品溶液各10μl进样测定,按上述色谱条件测定峰面积,外标法计算含量,结果山核桃叶中DHMC的含量为7.916mg/g,达0.79%。3超声提取和水浴回流提取提取流动相的选择试验过程中采用了100%、80%和60%的甲醇溶液提取,三者均可得到较好的分离效果,且测得的结果无明显差异,鉴于便捷性和稳定性考虑,采用100%甲醇为提取溶剂;在提取方法的选择上,采取超声提取和水浴回流提取两种方法作对比,二者测得的结果无明显差异,从简便和节能上考虑,采用了超声处理法提取;在流动相选择上,对两种洗脱系统进行比较,即乙腈-水(65∶35)、甲醇-水(65∶35),结果显示采用甲醇-水(65∶35)为流动相,峰形与分离效果最好,故选择