rp-hplc法测定木豆叶中球松素的含量

rp-hplc法测定木豆叶中球松素的含量

木豆叶，又名柳豆叶，来自科豆科植物cajanacanan（l.）milsp干燥叶。基源植物木豆在我国海南、广东、广西、四川、云南、福建及台湾等省区均有栽培,资源丰富。木豆叶有解痘毒、消炎肿之功效,现代药理实验与临床研究提示该药对骨及软组织感染等疾病有显著的疗效,且使用安全。广州中医药大学与浙江海正药业在此基础上将木豆叶开发成为治疗股骨头缺血性坏死的药物“通络生骨胶囊”,临床治疗股骨头坏死安全有效。目前对木豆叶药材的质量研究尚欠缺。我们参照文献报导从木豆叶药材中分离得到异美五针松二氢黄酮(Pinostrobin,球松素)作为对照品,采用高效液相色谱法对不同木豆叶药材样品中的含量进行了分析。1仪器和试剂盒1.1仪器、试药和仪器DIONEXSUMMIT高效液相色谱仪(P680HPLC四元梯度泵、STH585柱温箱、PDA-100检测器、ASI-100自动进样器);Chromeleon色谱工作站;KQ3200DE型医用数控超声仪;艾科浦U系列试验室专用超纯水机(重庆颐洋企业发展有限公司);SartoriusCT225D电子分析天平。1.2木豆及球松素对照品木豆叶3批,批号:090811、090812、090813,购于广州中医药大学大药房,经广州中医药大学苏子仁研究员鉴定为豆科植物木豆Cajanuscajan(L.)Millsp.的干燥叶;球松素对照品,自制(纯度≥99.0%,中国广东分析测试中心测定);试剂:超纯水、甲醇(色谱纯、分析纯),乙醇(分析纯)。2方法和结果2.1流动相、柱温色谱柱:PhenomenexlunaC18柱(250mm×4.60mm,5μm);流动相:甲醇-水,梯度洗脱,洗脱程序见表1;流速:1.0mL·min-1;柱温:35℃;检测波长为287nm。理论板数按球松素峰计算均不低于10000。在以上色谱条件下,木豆叶中的球松素与其他组分的色谱峰分离度良好。见图1。2.2对照品储备液精密称取球松素对照品0.01081g,置10mL容量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,得球松素对照品储备液(1.081mg·mL-1)。分别精密吸取0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.8mL、1.5mL球松素对照品储备液至10mL容量瓶中,加甲醇稀释至刻度,即得不同浓度的球松素对照品溶液(0.011mg·mL-1～0.162mg·mL-1)。2.3超声处理法取木豆叶,粉碎,取约0.5g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇50mL,密塞,称定重量,超声处理30min(功率250W,频率50kHz),放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,以0.45μm微孔滤膜滤过,即得。2.4标准曲线的绘制分别精密吸取不同浓度的球松素对照品溶液,进样10μL,按上述色谱条件测定峰面积,并以浓度(mg·mL-1)为横坐标,以峰面积为纵坐标进行线性回归,得标准曲线。结果表明,球松素在0.011mg·mL-1～0.162mg·mL-1浓度范围内线性关系良好,回归方程为Y=568.06X-0.76,r=0.9999。2.6进样稳定性测定取同一批木豆叶样品(批号:090811)按供试品制备方法制成供试品溶液,分别于第0h、2h、4h、6h、12h、24h进样10μL,按上述色谱条件进行测定,测得球松素的平均峰面积为15.705,RSD为1.41%,结果表明供试品溶液在24h内稳定。2.7重复性试验取同一批木豆叶样品(批号:090811),按供试品制备方法平行制备6份供试品溶液,分别进样10μL,按上述色谱条件进行测定,计算测得球松素的平均含量为2.613mg·g-1,RSD为1.49%,结果表明本方法重复性良好。2.8对照品溶液的制备取已知含量的木豆叶样品(批号:090811),粉碎,取约0.25g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入球松素对照品储备液(1.081mg·mL-1)0.3mL、0.5mL、0.8mL,按供试品制备方法制备。每一浓度平行操作3份,按上述色谱条件进行测定。测得球松素平均回收率为100.13%,RSD为1.01%,结果见表2。2.9样品含量的测量3讨论2.5主要提取溶剂及提取方法的选择精密吸取浓度为0.043mg·mL-1的球松素对照品溶液10μL,按上述色谱条件进行测定,重复6次,测得球松素的平均峰面积为24.462,RSD为1.23%,说明本方法精密度良好。取3批木豆叶样品,按供试品制备方法制备供试品溶液,分别进样10μL,并按上述色谱条件进行测定,计算各批木豆叶中球松素的含量。结果见表3。3.1在提取溶剂的选择上,分别考察了甲醇、75%乙醇、乙酸乙酯。结果发现,使用甲醇作为提取溶剂能有效提取出木豆叶中的球松素,故选用甲醇作为提取溶剂。在提取方法的选择上,考察了加热回流及超声处理,结果发现二者对球松素的提取效果没有明显差异。考虑到超声处理