安徽大别山森林土壤球孢白僵菌种群遗传多样性的issr分析

安徽大别山森林土壤球孢白僵菌种群遗传多样性的issr分析

白僵尸病毒是一种常见的、可引起昆虫白僵尸疾病的细菌。目前已被开发用于真菌杀虫剂,并被广泛应用于防治农林害虫。不同的森林生态系统中虫生真菌群落多样结构差异极大,其中球孢白僵菌的相对多度、优势度以及季节分布差异也很大。而且已知白僵菌自然种群中存在较大的异质性和较高的遗传多样性。但目前对不同森林生态系中的白僵菌群体的遗传结构和多样性水平的研究报道较少。现代分子生物学技术的飞速发展为真菌遗传结构的研究提供了愈来愈精确和可靠的分子标记。尤其是由Zietkiewicz等创建的ISSR(简单序列重复区间扩增多态性)分子标记,由于其引物序列较长,退火温度高,具有更高的重复性,且操作简单,已被广泛用于检测种内遗传变异。笔者拟应用该技术对麻姑山马尾松纯林、琅琊山天然次生林的白僵菌种群遗传多样性进行研究,并结合李旻等对大别山原始林中球孢白僵菌遗传多样性的研究,综合分析不同森林生态系中球孢白僵菌的遗传多样性指数以及基因流、遗传分化等。旨在揭示白僵菌自然群体在不同森林生态系中的遗传结构和遗传多样性,推测不同生态系中白僵菌基因交流状况。1材料和方法1.1真菌虫株的筛选分别于2005年3月至2006年1月和2007年3月至2008年1月在安徽省滁州市琅琊山国家森林公园和安徽省宣州市麻姑山马尾松林场随机设置样地采集感染真菌虫尸,经分离、纯化,共得到采集自琅琊山的白僵菌496株,采集自麻姑山的白僵菌111株。现保存于安徽农业大学微生物防治省重点实验室。从琅琊山群体中随机挑选出111株球孢白僵菌与麻姑山白僵菌群体比较研究。所选的白僵菌群体在安徽省的分布见图1,各群体所在地及其生境状况见表1。1.2培养条件设置将供试菌株接种到加铺玻璃纸SDAY培养基上。置于光照培养箱中(25±1)℃培养6d左右。待大量产生菌丝后,从玻璃纸上剥离菌体,冻干菌丝备用。1.3提取dna和依斯r索引物质采用改进的CTAB方法提取菌体总DNA,用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。参考文献,选出合适的引物序列(表2)。1.4pcr扩增及电泳检测ISSR-PCR扩增反应在FlexigenePCR仪上进行。反应体系(15μl)如下:1.5μl10×PCRBuffer,0.25μldNTPs,0.6μl引物,0.5UTaqDNA聚合酶和20ng模板DNA。PCR扩增程序:94℃预变性2min,接着进行35个循环;94℃变性45s,48～54℃复性45s,72℃延伸1.5min。循环结束后72℃延伸10min。PCR产物在2.5%琼脂糖凝胶上电泳分离,EB染色后用GIS-2008凝胶成像系统检测拍照。用AlphaEaseFC软件分析数据。1.5条带迁移率分析将电泳图谱利用BandScanV5.0软件进行电泳条带迁移率分析,把同一迁移率的条带视为公共带,其余为特异带,表示有多态性。分别记为“1”(代表显性基因)和“0”(代表隐性基因),把迁移率数据转化成0、1矩阵。1.5.1多态位点的比例多态位点百分率(PPL)就是在所有检测到的位点中多态位点所占的比率。计算公式为:PPL=多态位点数/检测到的位点总数×100%。1.5.2物种均匀度指数Shannon-Wienner指数来源于信息理论,指数越高,群落所含的信息量越大,此外还反映物种的均匀度。其计算公式为:I=-∑Pilog2Pi。式中,Pi为某一扩增带出现的频率。1.5.3平均位点杂合度平均杂和度是指各个亚种群在某微卫星位点平均杂合子的比例。假设一个标记位点上n个等位基因的频率分别为P1,P2,…,Pn,则j=∑i=1mP2i,He=1−∑i=1mP2i,J=IL∑i=1mji,H=1−J=1−IL∑i=1mjij=∑i=1mΡi2,Ηe=1-∑i=1mΡi2,J=ΙL∑i=1mji,Η=1-J=1-ΙL∑i=1mji。式中,j为位点纯合度;He为位点杂合度;J为平均位点纯合度;H为平均位点杂合度;L为位点数,m为某位点的等位基因数,pi为某位点第i个等位基因的频率。1.5.4基因数ni实际观察等位基因数为种群在该位点实际测到的等位基因数目,有效等位基因数(Ne)是位点纯合度的倒数,反映了基因间的相互影响,也可作为遗传变异的一个测度。Ne=1/j=1/∑i=1mP2i=1/(1−He)Νe=1/j=1/∑i=1mΡi2=1/(1-Ηe)。1.5.5种群杂度的计算遗传分化系数(Coefficientofgenedifferentiation,Gst)的计算公式为:Gst=(HT-HS)/HT。式中,HT为种群总杂合度;Hs为亚种群杂合度,即各亚种群平均杂合度。Gst越高,Hs/HT值就越小,表明亚种群遗传分化对种群总遗传分化贡献越小。2结果与分析2.1引物的扩增结果对所合成的ISSR引物进行筛选,选择了扩增结果较稳定、多态性好的7个引物对琅琊山群体和麻姑山群体共222株个体进行PCR扩增,同时引用李旻等对大别山球孢白僵菌群体研究结果进行比较研究。该研究中7个引物扩增出的条带数目从5到12不等,共扩增得到58个清晰的条带,其中多态性条带56个,占96.55%。引物P08的扩增结果见图2。琅琊山种群、麻姑山种群和大别山种群3个群体的多态性位点分别为96.55%、93.10%和81.00%(表3)。由表3可以看出,琅琊山群体的多态位点最高,大别山群体的多态位点最低,这可能是由于供试菌株较少造成的。但大别山群体的Nei’s基因多样性He和Shannon’s信息指数I分别为0.3187、0.4782,为3个不同森林生态系群体最大,其中人工纯林麻姑山群体Nei’s基因多样性He和Shannon’s信息指数I最小,分别为0.2552、0.3825。2.2群体遗传分化和基因流变根据总的基因多样性(Ht)和群体内基因多样性(Hs)计算不同群体间的分化水平(Gst),结果得到琅琊山群体和麻姑山群体间的遗传分化系数Gst=0.1283,表明这2个群体总的遗传变异中有12.83%存在于群体间;群体内的遗传变异为87.17%,说明遗传变异主要来源于群体内。基因流Nm=3.3984,群体间的基因流值若小于1(Nm<1),有限的基因流就是促使群体发生遗传分化的主要原因。该研究结果表明,种群内变异是促使种群间发生遗传分化的主要原因。李旻等研究大别山白僵菌群体总基因多样性(Ht)为0.3129,群体内基因多样性(Hs)为0.2807,按菌株的不同采集季节分析基因分化系数Gst为0.1028,说明大别山白僵菌的遗传变异亦主要是来源于种群内。可以看出3种不同森林生态系中球孢白僵菌各种群间的遗传分化系数都较小,可能与球孢白僵菌生态适应性强有关。2.3认识主体资格与聚类分析根据Nei’s遗传距离,利用UPGMA法构建了采集自琅琊山和麻姑山白僵菌个体的遗传关系聚类图(图3)。由图3可以看出,采集自同一森林生态系中的球孢白僵菌具有相似的基因型,琅琊山菌株明显聚在一起,麻姑山菌株聚为另一支。3不同种类球孢白难以菌群的遗传多样性研究结果表明,琅琊山球孢白僵菌群体多态位点比率最高,为96.55%,大别山球孢白僵菌群体多态位点比率最小,为81.00%。这可能与不同林区采集到球孢白僵菌菌株的多少有关,菌株越少出现多态位点的比率越小;大别山球孢白僵菌的Nei’s基因多样性(He)和Shannon信息指数(I)都为最高,分别为0.3187、0.4782;麻姑山白僵菌群体的Nei’s基因多样性(He)和Shannon信息指数(I)都为最小,分别为0.2552、0.3825;琅琊山群体其次,分别为0.2781和0.4299。可见大别山生态环境复杂的原始森林,尽管采集到的白僵菌菌株较少,但是其遗传多样性指数最高。而海拔较低的麻姑山林场是丘陵岗地,林分是人工纯林马尾松林,在林农交界处,完全处于人为干预的影响下,其球孢白僵菌遗传多样性指数则较低。人为干扰较少的天然次生林琅琊山森林公园白僵菌种群的遗传多样性指数居中。利用Nei’s遗传距离结合UPGMA的聚类分析结果,将采集自琅琊山和麻姑山的222株球孢白僵菌基本按不同采集地分为了2个遗传组。周娜等利用ISSR技术研究了采集自不同区域的紫色野村菌种群异质性时,发现了相似的规律,利用UPGMA方法构建的系统树将22株紫色野村菌按照2个不同采集区域分为2个类群。这说明空间距离对真菌的基因交流