克氏原螯虾过敏反应模型的构建及评价

克氏原螯虾过敏反应模型的构建及评价

克氏原始虾，也被称为小龙虾，是近年来中国水产养殖面积显著增加的淡水养殖。近年来，江苏省已发展成为小型虾业中的“著名商”。这种小型虾的消费令人难以置信，已经成为众所周知的餐桌餐食之一。克氏原螯虾是营养价值较高的食品,深受普通消费者喜爱,但由于部分人群食用小龙虾后会产生食物过敏症状,部分报道有横纹肌溶解症状,给部分人群的食用健康带来威胁通常发生食物过敏是由于食物中的过敏原成分诱导机体的免疫系统发生超敏反应,并且通常是速发型的,典型的指标就是测定血清中的IgE抗体,同时抗原抗体的特异性结合会释放出炎症因子,如组胺,会带来机体的红肿热痛等基本炎症效果,对人体健康带来威胁1材料和方法1.1实验试剂和动物克氏原螯虾,购于淮阴工学院附近水产市场,立即用清水洗净表面,然后置于超低温冰箱中,-80℃保存,待用;鼠源血清IgE抗体、组胺、IFN-γ、IL-4、IL-6等小鼠血清ELISA试剂盒购自于广州优迪生物。其它试剂均为国产分析纯。模型动物选用SPF级别的雌性Balb/c小鼠,自南方医科大学动物实验中心购买,在广州科学城孵化器实验动物中心开展饲喂实验,实验操作均符合实验动物伦理规定的要求。主要设备有松下MDF-U3386S立式超低温冰箱、贝克曼库尔特AvantiJ-E多用途高效离心机、赛默飞世尔FC型全自动酶标仪、德国SRKLYOGT2型冷冻干燥机。1.2方法1.2.1克氏原始虾粗蛋白的制备参考张杰等1.2.2小鼠的致敏试验实验小鼠共分为两组:皮下注射致敏组和PBS对照组。提取到的克氏原螯虾蛋白经皮下注射入致敏组小鼠体内,对照组采用PBS溶液代替,各组小鼠采用非含鱼粉饲粮饲喂,预饲一周后开始正式试验,连续三周按0.25mg/mL致敏原剂量进行致敏操作,末次致敏的隔日进行致敏的激发,剂量加倍。1.2.3小鼠致敏生理性状的观察小鼠经致敏及激发操作后,通过对小鼠尾静脉注射EvansBlue染液,通过观察小鼠足部肿胀情况及生理变化情况,了解致敏过程炎症因子对血管通透性上的影响,从而确定小鼠是否发生食物过敏反应及反应严重程度。1.2.4大鼠血清指数的模型测定采用小鼠摘眼球取血,参考赵祥杰1.2.5数据分析分析检测指标均进行三次重复,各数据利用SPSS12.0软件进行统计分析。组间差异性显著采用t检验,显著水平为P<0.01。2结果与分析2.1皮肤长期致敏组小鼠焦失压检测模型小鼠发生食物过敏反应时,其在生理性状上会发生改变,过敏时的炎症反应会产生瘙痒、皮疹等症状,实验中发现,致敏组小鼠会在鼠笼中焦躁不安,皮肤摩擦鼠笼情况较为常见。通过在其尾部注射EvansBlue染液(图1),结果发现致敏组(图1A)小鼠足部充血较空白对照组(图1B)严重,说明发生食物过敏反应时,由于炎症因子的作用,带来毛细血管通透性的提高,因此致敏小鼠多部位被染液染成蓝色。2.2血清抗体含量小鼠发生食物过敏时会出现典型的I型超敏反应,血清中特异性sIgE会大量产生,而通过测定模型动物血清中的抗体含量,是判定模型结果的一个重要标志。从图2中可以看出,致敏组小鼠血清中IgE抗体的浓度达到10.5ng/mL,而对照组小鼠血清中IgE的含量仅为3.5ng/mL,说明模型致敏组小鼠产生了明显的食物过敏反应。2.3酰胺的含量测定发生食物过敏时小鼠机体会产生大量的sIgE用于机体免疫,当特异性抗体与致敏原物质发生特异性结合时,诱导结合的肥大细胞释放组胺物质,而组胺物质会产生严重的炎症反应,给身体健康带来重大威胁,因此组胺的含量是确定抗体产生及其与抗原结合的重要指标,在食物过敏研究中具有重要意义2.4食物不良反应试验中t细胞的生长白介素细胞因子是免疫过程中具有典型意义的指标,是速发型超敏反应过程中T细胞所分泌的,如IL-4、IL-6等均是食物过敏反应中产生的细胞因子。从图4中可以看出致敏组小鼠血清中的IL-4和IL-6细胞因子的含量均高于对照组中所测定的含量,而且具有统计显著性差异。2.5t细胞免疫分型血清中的IFN-γ是自体免疫中细胞免疫的主要效用成分,是与I型超敏反应效应物质截然不同的组分,也是对T细胞免疫分型的重要参考。从图5中可以看出,致敏组模型小鼠血清中IFN-γ含量为22.7pg/mL,而空白对照组小鼠血清中IFN-γ含量为90.3pg/mL,致敏模型组IFN-γ含量低于其空白对照组,且达到显著水平(P<0.01)。由上可知,均表明模型组小鼠产量显著的I型超敏反应,模型初步构建成功。3开展产品普遍认可性研究,提高产品的市近年来克氏原螯虾产业获得了较快发展,克氏原螯虾消费量惊人,但由于食用过敏或引发横纹肌溶解症的情况时有报道,引发普通消费者对食用克氏原螯虾安全的忧虑,因此开展其过敏性研究对于提高产品健康食用和行业的快速稳定发展具有重要意义。开展克氏原螯虾动物过敏模型的研究是解决食物过敏抗体来源的重要步骤,也是相关研究的基础。本文以克氏原螯虾食物过敏动物模型研究为目的,通过生理性