免疫共沉淀原理和注意事项

免疫共沉淀原理和注意事项免疫共沉淀原理和注意事项第1页一试验原理以（抗体和抗原）之间专一性作用为基础用于研究（蛋白质相互作用）经典方法。是确定两种蛋白质在完整（细胞内生理性）相互作用有效方法。假如用蛋白质X抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合蛋白质Y也能沉淀下来。

问题：细胞怎样保持生理状态-不变性？Y-X-抗X免疫共沉淀原理和注意事项第2页CO-IP应用与IP区分测定两种目标蛋白质是否在体内结合确定一个特定蛋白质新作用搭档CO-IP与IP只取决于检测焦点是初级靶分子（抗原）还是次级靶分子（相互作用蛋白）免疫共沉淀原理和注意事项第3页试验基础原理1.提取蛋白2.在细胞裂解液中加入抗X抗体3.孵育后再加入ProteinA或G(于Agarosebead上)若细胞中有与兴趣蛋白结合目标蛋白，就能够形成复合物：“Y—X—抗X抗体—ProteinA或G"3.经变性、聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物又被分开。（xy抗原、x抗体）proteinA/G有一个很主要特征就是能与抗体Fc段结合agarosebead琼脂糖珠免疫共沉淀原理和注意事项第4页CO-IP原理图解免疫共沉淀原理和注意事项第5页proteinA/G-琼脂糖珠复合物ProteinA是一个金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质，能特异性地与人和哺乳动物抗体（主要是IgG）Fc区结合。当前多用proteinA/G预先结合在argarosebeads上。免疫共沉淀原理和注意事项第6页ProteinA/G作用及详细原理“捕捉”抗体，形成复合物，抗体-目标蛋白-ProteinA/Gbeads非共价健结合ProteinA/G-garosebeads共价结合加样缓冲液-煮沸变性-离心ProteinA/Gbeads↓EP管（抗体-目标蛋白-少许非特异性吸附蛋白）。免疫共沉淀原理和注意事项第7页二CO-IP特征优点（1相互作用蛋白质都是经翻译后修饰，处于天然状态（2蛋白相互作用是在自然状态下进行，能够防止人为影响（3能够分离得到天然状态相互作用蛋白复合物免疫共沉淀原理和注意事项第8页二CO-IP特征不足（1可能检测不到低亲和力和瞬间蛋白质－蛋白质相互作用（2两种蛋白质结合可能不是直接结合，有第三者在中间起桥梁作用；（3必须在试验前预测目标蛋白是什么，以选择最终检测抗体，若预测不正确，试验就得不到结果。免疫共沉淀原理和注意事项第9页三试验流程

提取细胞总蛋白↓

↓离心，上清电泳(抗原抗体)准备PA珠子，PBS洗3遍↓PA珠子加入蛋白裂解液（去除非特异性蛋白背景)↓离心去PA珠子，取上清↓测蛋白浓度(BCA法)↓加一抗反应(4℃过夜)↓加PA珠子捕捉复合物(室温1h或4℃过夜)↓离心，搜集沉淀，预冷RIPABuffer洗3遍↓上样缓冲液悬浮沉淀，加热游离抗原、抗体、珠子

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免疫共沉淀原理和注意事项第10页四试验结果分析SDSWesternblotting分析质谱分析检测目标蛋白免疫共沉淀原理和注意事项第11页SDS结果分析标难曲线只对同一块凝胶上样品分子量测定才含有可靠性。以每个蛋白标准分子量对数对它相对迁移率作图得标准曲线，量出未知蛋白迁移率即可测出其分于量。

免疫共沉淀原理和注意事项第12页一抗一抗一抗(兔抗Actin)

曝光后蛋白条带二抗(辣根酶标识羊抗兔IgG)ECLX光片曝光显影ECL试剂含有转印蛋白PVDF膜

++转印膜上蛋白检测示意图

WB结果分析免疫共沉淀原理和注意事项第13页CO-IP与质谱分析流程免疫共沉淀原理和注意事项第14页三试验关键1.试验最需要注意点就是抗体性质。尤其是多抗特异性是问题。2.为预防蛋白分解、修饰，溶解抗原缓冲液必须加蛋白酶抑制剂，低温下进行试验。3.考虑抗体/缓冲液百分比。抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在beads上，残余在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。4.确定蛋白间相互作用是发生在细胞中，而不是因为细胞溶解才发生，这需要进行蛋白质定位来确定。？？免疫共沉淀原理和注意事项第15页注意问题：1.裂解液细胞裂解采取温和裂解条件，不能破坏细胞内存在全部蛋白质－蛋白质相互作用，多采取非离子变性剂（NP40或TritonX-100)。每种细胞裂解条件是不一样，经过经验确定。不能用高浓度变性剂（0.2％SDS)，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化cocktailer。免疫共沉淀原理和注意事项第16页RIPA裂解液--普利莱基因技术有限企业100mlRIPABuffer：50mMTris-HCl(pH7.4),150mMNaCl,1%NP-40,0.1%SDS.（100元）说明：1.裂解液临用前可新鲜加入最终浓度为1mMPMSF或其它蛋白酶抑制剂。2.RIPA裂解液中蛋白样品含有较高浓度去垢剂，不能用Bradford法但可用BCA法或改良Lowry法测定蛋白浓度免疫共沉淀原理和注意事项第17页裂解液成份我国博士：细胞裂解液：50mMTris-HC（lpH7.5），150mMNaCl,0.5%NP-40,1mMEDTA使用前加入PMSF至终浓度1mM、proteinaseinhibitorcocktail（混合物）。刘岩BC300buffer20mMTris-Cl,pH8.0,300mMNaCl,0.2mMEDTA,10%glycerol（甘油）,0.2mMPMSF,0.2%Tween20免疫共沉淀原理和注意事项第18页2.1免疫沉淀中抗体选择免疫共沉淀原理和注意事项第19页注意问题：2.2抗体使用对照抗体：（阴性和阳性）阴性：

单克隆抗体：同一个属IgG

兔多克隆抗体：正常兔IgG阳性：细胞内某种蛋白抗体（做膜蛋白A，用膜蛋白B）免疫共沉淀原理和注意事项第20页未检测到目得蛋白或蛋白极少可能原因 处理方法1.样品被蛋白酶降解：添加蛋白酶抑制剂；全部操作保持4℃以下冰上操作并预防冻融2.抗体浓度太低：调整抗体浓度，必要时设置浓度梯度，探索最正确浓度3.抗抗体亲协力太低：选取适合于IP和/或IB对应抗体4.IP抗体未与agarose珠子结合：选取适合于IP对应珠子，正确保留预防变质或干燥5.Tag未暴露在融合蛋白构象表面：改变tag融合表示部位6.裂解液严谨度太高：改用低严谨度裂解液免疫共沉淀原理和注意事项第21页目得蛋白高背景：可能原因 处理方法非特异蛋白结合 在无血清培养液中裂解细胞；在免疫沉淀前用protein(G/A)珠子预洗，免疫沉淀后增加漂洗次数和严谨度（高盐或去垢剂）裂解液严谨度太低 改用高严谨度裂解液试验仪器或液体被污染 使用洁净仪器或液体转移膜上非特异吸附 戴手套，用镊子夹取，不要接触膜转移面免疫共沉淀原理和注意事项第22页试剂RIP