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文档简介

试验目标了解双向琼脂扩散原理和用途。掌握抗体效价测定方法。观察抗原、抗体在琼脂板中形成沉淀线。免疫扩散实验双向双扩散生物技术第四组专家讲座第1页试验原理双向双扩散简称双扩散，此法是一个定性试验。可溶性抗原与对应抗体在琼脂凝胶中各自向四面扩散，假如抗原和抗体相对应，则在二者百分比适当处形成白色沉淀线；若抗原和抗体无关就不会出现沉淀线。此试验能够检测抗原或抗体纯度，滴定抗体效价，以及用已知抗原（抗体）检测和分析未知抗体（抗原）。免疫扩散实验双向双扩散生物技术第四组专家讲座第2页试验材料生理盐水、1%琼脂（用于制作琼脂扩散试验平板）已知传染性法氏囊病毒抗原、待检血清打孔器、微量加样器、枪头、酒精灯、搪瓷盒等免疫扩散实验双向双扩散生物技术第四组专家讲座第3页试验步骤制板：称取1g琼脂粉，加入100ml生理盐水，煮沸使之溶解。待溶解琼脂温度降至60℃左右时倒入平皿中，厚度为2-3mm。注意勿产生气泡。打孔：待琼脂凝固好后用打孔器打孔，孔径和孔距依不一样疫病检疫规程而定，普通孔径3~5mm，孔间距4~7mm。孔型多为7孔，中央1孔，周围6孔（如梅花孔）。用针头挑出孔内琼脂。封底：将琼脂板无凝胶面在酒精灯火焰上轻轻灼烧，用手背感受微烫即可。免疫扩散实验双向双扩散生物技术第四组专家讲座第4页抗体效价测定：用微量加样器于中央孔加入已知抗原，于周围孔加倍比稀释血清，每个稀释度加1孔。加样时不要使样品外溢或在边缘残余小气泡，以免影响扩散结果。扩散：加样完成后，将琼脂板放于湿盒内，保持一定湿度，置于37℃温箱中扩散24~48小时观察结果。免疫扩散实验双向双扩散生物技术第四组专家讲座第5页图1免疫扩散实验双向双扩散生物技术第四组专家讲座第6页结果判定用以检测抗原或比较抗原差异时，将抗血清置中心孔，将待测抗原或需比较抗原置于周围相邻孔。若出现沉淀带完全融合，证实为同种抗原；若二者有部分相连，表明二者有共同抗原决定簇；若二条沉淀线相互交叉，说明二者抗原完全不一样。免疫扩散实验双向双扩散生物技术第四组专家讲座第7页用梅花孔检测抗血清效价，操作时将抗原置于中心孔，抗血清倍比稀释后置于周围孔，以出现沉淀带血清最高稀释倍数为该血清琼扩效价。若凝胶中抗原、抗体是特异性，则形成抗原抗体复合物，在两孔之间出现清楚致密白色沉淀线，为阳性反应。若在72小时内仍未出现沉淀线则为阴性反应。试验时最少要做一阳性对照。出现阳性对照与备检样品沉淀线发生融合，才能确定待检样品为真正阳性。结果判定免疫扩散实验双向双扩散生物技术第四组专家讲座第8页双向免疫扩散凝胶染色图免疫扩散实验双向双扩散生物技术第四组专家讲座第9页免疫扩散实验双向双扩散生物技术第四组专家讲座第10页注意事项浇制琼脂板时要均匀、无气泡。孔要打得圆整光滑，边缘不要破裂。加样时应尽可能防止气泡或加到孔外，以确保结果准确性。注意微量进样器每加一个样品之后，更换枪头。免疫扩散实验双向

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