绿色荧光蛋白

绿色荧光蛋白(GFP)原核表达情况分析姓名：韩吉梅学号：2013107001专业：作物栽培学与耕作学摘要：将含有绿色荧光基因的重组载体导入大肠杆菌中，经IPTG诱导产生大量融合蛋白，用SDS来确定目的蛋白的可溶性及其分子量。考马斯亮蓝染色4小时再过夜脱色，观察目的蛋白的分子量大约为31.9kD,与预期值相符。关键字：绿色荧光蛋白SDS原核表达1前言绿色荧光蛋白(greenfluorescentproteinGFP)是源于多管水母属等海洋无脊椎动物的发光蛋白，其在蓝光或紫外光下可发出明亮的绿色荧光，可以作为报告基因检测蛋白的特异性表达或进行细胞定位研究。绿色荧光蛋白还在监测目的基因表达、研究细胞内物质代谢及追踪细胞系的分化等方面有着广泛应用。由于GFP检测具有高灵敏度,操作简单，无需使用同位素等优点，近年来广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移以及相互作用、信号传递、转染与转化，以及细胞的分离与纯化等研究领域［1-2］。采用GFP作为标记基因，可直接收集转化细胞供实验，缩短了筛选时间、减少对细胞活性的影响并可作为活体标记，为研究发育的基因调控和分子机制提供了一种简洁有效的手段34］。同时也正因为其荧光反应不是酶反应，所以当细胞本身还存在一些可以受蓝光激发和产生绿色荧光的物质，或者GFP表达频率不高的情况下,GFP的检测可能会产生一些假相，不易对荧光进行定量的测定。我们利用基因工程手段在大肠杆菌中高效的表达了GFP,制备出GFP抗体，利用抗原与抗体之间的特异性，在体外对GFP进行检测，可在一定程度上弥补上述GFP检测中可能出现的问题，可以作为一种重要的辅助手段用以提高GFP检测的灵敏度和准确度⑸。原核表达是将克隆基因插入合适载体后导入大肠杆菌，用于表达大量蛋白质的方法。选用原核表达系统的原因是易于生长和控制、用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞培养的材料昂贵、有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。包涵体是在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，形成被膜包裹的结构，具有水不溶性的特点。本实验主要是通过SDS来检测绿色荧光的原核表达情况。2材料与方法2.1材料30%分离胶贮液分离胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液pH8.9）浓缩胶贮液浓缩胶缓冲液10%SDS20%过硫酸铵（AP）染色液脱色液1XSDS上样缓冲液1XTris-甘氨酸电泳缓冲液四甲基乙二铉(TEMED)2.2方法：2.2.1检测重组蛋白的可溶性将重组菌在含对应抗生素的LB平板上划线培养过夜。次日，挑取单克隆，接种到5mL含对应抗生素的LB液体培养基中，37°C,200r/min振荡培养过夜。将过夜培养的菌液100pl加入到10mLLB培养基中(1:100),200r/min振荡培养3h左右至OD600=0.6。加入IPTG诱导至1、2h，取500^1培养物10000rpm离心5min。弃上清，收集沉淀，加适量蒸馏水重悬细胞，超声波破碎5min,工作10s停10s。4C，10000rpm离心10min。分离上清和沉淀，上清直接加等体积Loadingbuffer，沉淀用蒸馏水重悬后，加等体积Loadingbuffer，沸水煮5min变性。SDS检测蛋白可溶性。2.2.2日的蛋白质的诱导表达及检测挑取单菌落，接入3ml含氨苄青霉素(50pg/ml)的LB培养液，37C培养过夜。取50^1过夜培养物接入3ml含氨苄青霉素(50pg/ml)的LB培养液，37C振荡培养2h以上，至对数期(A600=0.5〜0.6)。吸出500pl未经诱导的培养物放在一个微量离心管中，室温高速离心1min，沉淀悬浮于100^11xSDS凝胶加样缓冲液，100°C加热3min，备用。在剩余培养物中加入IPTG至终浓度1mmo1/L,37C继续培养30、60、90、120min，取500^1样品放于微量离心管中，室温高速离心1min。沉淀悬浮于100^1SDS凝胶加样缓冲液，100C加热3min，室温高速离心1min，待全部样品处理完后上样。2.2.3SDS将电泳槽玻璃板洗净，吹干，用胶条封边，装到制胶架上。配12%分离胶，制好的分离胶立即倒入凝胶槽内，至凝胶槽高三分之二处，加蒸馏水密封。待胶凝固后（约需30min）倒掉水，用吸水纸吸干。配5%浓缩胶，制好的浓缩胶立即倒入凝胶槽内（以插入梳子不溢出为宜），插入梳子。待胶凝固后，拔出梳子，放入电泳槽中制备好的样品加入上样孔。连接电泳仪打开电源，调整电压至80V，待样品跑过浓缩胶后将电压调至120V，待指示剂（溴酚兰）到达凝胶的底部距离下缘1cm时停止电泳，大约需2-3h，电泳结束。剥胶，染色。2.2.4日的蛋白质的检测-考马斯亮蓝染色将凝胶浸泡在染色液中，室温在摇床上缓慢染色4小时（或过夜）。2.2.5脱染将染液回收，凝胶先用蒸馏水漂洗一次，浸入脱染液中脱染，室温浸泡凝胶或37°C加热使其脱色，更换几次脱色液，直至出现清晰的电泳带为止。2.2.6脱色后，将凝胶保存在水中或是20%甘油的水中。3实验结果与分析左侧为沉淀条带，从左到右分别为0小时，0.5小时，1小时，1.5小时，2小时跑出的条带，中间为marker,右侧为上清液跑出的条带，从右到左依次为0小时，0.5小时，1小时，1.5小时，2小时条带。条带没有全部显示出来，沉淀跑出的条带比上清跑出的条带清晰，而且沉淀中的条带跑的越远越清晰。4讨论①图中没有把所有的条带显示出来，可能是点样时操作不当，或是把胶弄坏了致使边上的条带显示不出来。沉淀的条带比上清的清晰，说明上清中的可溶性蛋白少，但是没有包涵体，而沉淀的条带较明显说明可溶性蛋白主要存在于沉淀中，猜测也可能含有大量的包涵体。与marker相比可知沉淀条带在31.9kDa处最为明显为目标条带。此次试验过程中跑出的条带及其少，有些甚至整块胶看不到条带，可能是因为点样时操作不熟练使胶未能完全进入点样孔。5参考文献KainSR,AdamsM,KondepudiA,eta.lGreenfluorescentproteinasareporterofgeneexpressionandproteinlocalization.biotechniques,1995,19(4):650PhillipsGJ.Greenfluorescentproteinabrightideaforthestudyofbacterialproteinlocalization.FEMSmicrobialLet,t2001,204(1):9ChalfieM,Tu,EKivchenG,eta.lGreenfluorescentproteinasamarkerforgeneex