基因工程菌的发酵第十三章基因工程菌的发酵

第十三章基因工程菌的发酵近年来，重组DNA技术(基因工程)已开始由实验室走向工业生产，走向实用。它不仅为我们提供了一种极为有效的菌种改良技术和手段，也为攻克医学上的疑难杂症——癌、遗传病及艾滋病的深入研究和最后的治愈提供了可能；为农业的第三次革命提供了基础；为深入探索生命的奥秘提供了有力的手段。现在由工程菌产生的珍稀药物，如胰岛素、干扰素、人生长激素、乙肝表面抗原等等部已先后面市，基因工程不仅保证了这些药物的来源，而且可使成本大大下降。但是从许多研究中发现，工程菌在保存过程中及发酵生产过程中表现出不稳定性，因而工程菌不稳定性的解决已日益受到重视并成为基因工程这一高技术成就转化为生产力的关键之一。第一节工程菌的来源和应用一、何谓基因工程基因工程（geneticengineering）是指在基因水平上，采用与工程设计十分类似的方法，根据人们的意愿，主要是在体外进行基因切割、拼接和重新组合，再转入生物体内，产生出人们所期望的产物，或创造出具有新的遗传特征的生物类型，并能使之稳定地遗传给后代。基因工程的核心技术是DNA的重组技术。重组即利用供体生物的遗传物质或人工合成的基因，经过体外或离体的限制酶切割后与适当的载体连接起来形成重组DNA分子，然后在将重组DNA分子导入到受体细胞或受体生物构建转基因生物，该种生物就可以按人类事先设计好的蓝图表现出另外一种生物的某种性状。除DNA重组技术外，基因工程还应包括基因的表达技术，基因的突变技术，基因的导入技术等。基因工程一般分为4个步骤：一是取得符合人们要求的DNA片段，这种DNA片段被称为“目的基因”；二是将目的基因与质粒或病毒DNA连接成重组DNA；三是把重组DNA引入某种细胞；四是把目的基因能表达的受体细胞挑选出来。DNA分子很小，其直径只有20埃，约相当于五百万分之一厘米，在它们身上进行“手术”是非常困难的，因此基因工程实际上是一种“超级显微工程”，对DNA的切割、缝合与转运，必须有特殊的工具。要把目的基因从供体DNA长链中准确地剪切下来，可不是一件容易的事。1968年，沃纳·阿尔伯博士、丹尼尔·内森斯博士和汉密尔·史密斯博士第一次从大肠杆菌中提取出了限制性内切酶，它能够在DNA上寻找特定的“切点”，认准后将DNA分子的双链交错地切断。人们把这种限制性内切酶称为“分子剪刀”。这种“分子剪刀”可以完整地切下个别基因。自70年代以来，人们已经分离提取了400多种“分子剪刀”。有了形形色色的“分子剪刀”，人们就可以随心所欲地进行DNA分子长链的切割了。DNA的分子链被切开后，还得缝接起来以完成基因的拼接。1976年，科学们在5个实验室里几乎同时发现并提取出一种酶，这种酶可以将两个DNA片段连接起来，修复好DNA链的断裂口。1974年以后，科学界正式肯定了这一发现，并把这种酶叫作DNA连接酶。从此，DNA连接酶就成了名符其实的“缝合”基因的“分子针线”。只要在用同一种“分子剪刀”剪切的两种DNA碎片中加上“分子针线”，就会把两种DNA片段重新连接起来。把“拼接”好的DNA分子运送到受体细胞中去，必须寻找一种分子小、能自由进出细胞，而且在装载了外来的DNA片段后仍能照样复制的运载体。理想的运载体是质粒，因为质粒能自由进出细菌细胞，应当用“分子剪刀”把它切开，再给它安装上一段外来的DNA片段后，它依然如故地能自我复制。有了限制性内切酶、连接酶及运载体，进行基因工程就可以如愿以偿了。运载体将目的基因运到受体细胞是基因工程的最后一步，目的基因的导入过程是肉眼看不到的。因此，要知道导入是否成功，事先应找到特定的标志。例如我们用一种经过改造的抗四环素质粒PSC100作载体，将一种基因移入自身无抗性的大肠杆菌时，如果基因移入后大肠杆菌不能被四环素杀死，就说明转入获得成功了。二、工程菌的获得1，确定目的产物。2，找出产该产物的细胞。3，将细胞破碎后提纯出全部信使RNA。这些信使中包含了该细胞内表达的所有蛋白质的合成信息。4，利用基因扩增技术（PCR），找出所需的目的基因。5，将目的基因连接到设计好的质粒载体，形成了重组DNA分子。6，将重组后DNA分子引入到受体细胞内，然后选择合适的培养条件使细胞繁殖。根据选择性标记，从菌落中筛选出目的基因的重组(工程)菌。租三、住工程单菌应瓦具备木的条注件纠1，迷发酵鹊产品效是高删浓度液、高困转化篮率和薯高产谦率的娱，同贪时是描分泌好型菌诚株。谣2，坑菌株锣能利政用常授用的侨碳源梨，并奏可进舅行连糟续发朋酵。豪3，厅菌株瓜不是蔽致病瓣株，慢也不傍产内或毒素范。畏4，傻代谢勉控制获容易雄进行沃。跑5，隐能进麻行适辰当的诵DN颜A团重组内，并夫且稳驾定，罪重组拳的坑DN米A抵不易冰脱落揉。狸四、狱工程尊菌的仰应用固1惊，基驱因药伍物扁例如播，红缎细胞塞生成喇素、墙胰岛荒素、阴干优露素、桶乙肝丝疫苗盆、生鸭长激励素和误粒细的胞巨泡噬细桌胞集普落刺轿激因焰子等神。衬2翼，其总它发防酵产雁品承例如眠酶制弟剂、筛氨基娘酸（然苏氨捏酸、雷色氨笋酸）谣、抗依生素球等。唐第二却节座纵询工程博菌的拿培养储就生词产流遥程而揪言，陷从发怜酵到谈分离面、纯我化目执标产抹物，分工程我菌和微常规催微生醒物并则无太杨多的首差异目。但状工程供菌在纷保存全过程贪中及垃发酵龄生产神过程疾中表缴现出饲不稳创定性副，以翼及安贼全性改等问夜题，仍使得亏工程波菌的滨培养炎有着呢自身偏所特孔有的逢特点仿。闪员一、可安全高问题鸦关于罪基因嫌工程剃的社隙会问构题，近必须铜提到孟它的跑潜在宜危险悟性。掌经过肢重组促的菌拢和质况粒一乞旦用凉于，院工业亡化生状产，积就不浙可避柄免地跪进入各自然猜界。肠这些塌菌能涛间接盗地危第害人怕体健隶康，腥使治越疗药辞物失释去效共用，糟污染泥环境腿等。困因此惰，安杆全问丛题是根极其浩重要榜的。中肥夜19孕74档年，模提出习了D价NA泊重组感实验征具有旷潜在沙生物亏危险耀性的壁问题衰。后吴来，倾美、据日等仗国都色制定爪了有玉关D堡NA葛重组盘实验花的准淹则，藏即在谷试管铸内用滚酶等挺构建嫂异种忙DN恐A的栏重组失分子颜，并栽用它莫转入仍活细伴胞中组的实钢验，查以及锹使用切重组摸体的阔实验青应遵剩循的伪规程劳。其锯目的挽是保融证实逝验的展安全键和推索动重剪组D草NA权的研毯究。麻这些渠准则算参照友了防游止病砌原微柔生物姓污染肆的措押施，孔以及候根据水对实备验安甚全度圆的评筒定，罚采用珍物理剂密封秘(P浆1~池P4揉)和抓生物怖学密蜘封(粉B1夜和B详2)滤两种立方法辞。纳贿扣物理沫密封原是将轰重组类菌封屋闭于瓦设备奥内，弱以防醋止传柱染给感实验泼人员标和向歼外界本扩散撇。实见验规逮模在定20叮L以屋下时分，物干理密偷封由互密封烛设施盗、实标验室汤设计脚和实耗验注雪意事遵项组罚成。享密封监程度前分为彻P1瓶、P恭2、贼P3脏和P忙4级阵，数喘字越快大，望密封盏水平死越高恳。生觉物学粉密封久要求哲用只贿有在蛙特殊安培养盟条件紫下才尽能生租存的孟宿主际，同至时用润不能祥转移雀至其那它活锄细胞进的载真体，壶通过卷这样降组合浸的宿传主载疏体系许统，殊可以鲁防止属重组斩菌向锡外扩矩散。碰按密抛封程物度分谊B1理和B戏2级销，B讯2级裤的密乏封要上求最你严格逼。初堂今企业业中进页行重刷组菌益培养驾时的鬼设备稳标准宪有L宋S-拾1和筛LS园-2寨。L纹S-畏2相平当严郑格，欣工业应生产码起码柳应在闭LS桶-1狼的设承备标松准下备培养厕。L凉S-进1标垮准要湖点是雨：(蜻1)箭使用遍防止匀重组炊菌体容外漏婆，能轨在密宇闭状小态下贡进行户内部欠灭菌涝的培俭养装厨置；累(2寇)培辫养装朽置的介排气潮由除仁菌器篮排出映；(风3)白使用员易产未气溶馅胶的词设备宽时，输要安启装可原收集程气溶位胶的椒安全朱箱等知。设泊计用服于基妹因重护组菌陷的培写养装映置时姓，不站仅要沿考虑例外部叙杂菌务的侵常入，准还要饼防止搅重组宁菌的滑外漏贺。此友外，迁培养首后的笋菌体严分离愈、破仰碎等美处理叶也必此须在导安全电柜内估进行丘，或道是采掩用密咳闭型筛的设电备。武二、让基因挺工程功细胞客培养退特点怠勿血前已姻述及强，基厨因工肚程细半胞培挤养过封程与富培养蓄方式拾与天夹然细寿胞培磁养过察程或字方式挡基本母—慢致。蠢但亦欠有其雹自身裙持点包。实垃践表泡明，唯基因击工程界细胞迅工业揭化培拖养中挖，产哑物的锋产率去往往皱比实诊验室江培养剧规模结为低利。其找原因议主要辛与基辩因工缘程细彩胞特秀点有杂关，盈首先组基因内工程丈细胞阁的生融长速息率及思表达兄率与相其所揉载外上源D梦NA方的稳懂定性欲及产丝物分尺泌过拳程有收关，岩其中露重组垦DN默A的下稳定捆性尤裤为重殃要，恭重组注DN碑A在罚宿主可内表危达方吵式有着两种今，其珠一是洪游离荣表达返方式瓣、其诉二是鹿结合兼表达统方式善。因计此，捡基因蓄工程昏细胞第培养技过程拨，重奇组D铺NA伞的丢号失方赶式亦斗有两限种，愈其一冒是细命胞培讽养过隶程，振由于差回复记突变扁或分核配作胜用致握使D摊NA送丢失晚．称铸为脱偶落性引不稳都定，颂其二岔是重国组D火NA辈中编队码的嫁结构资基因梯在宿昂主内判发生逢再重布组过妖程产纷生突紫变，雀不再立表达南目的悬产物成，此相称加拦结构敲性不蔽稳定决。其联次为刑提高潮基因仆工程伙细胞胡表达犁效率畜，需呼采取族适当掩措施冲，提咳高重烤组D芝NA距在宿燃主细奏胞内胃的拷俘贝数基及促费进表镜达产重物自梁细胞潜内向负细胞援外分抢泌。繁此外山，基手因工苏程细迎胞的啄原宿冈主通斩常是绣某些赏培养续物质在(如绵某种搞氨基泛酸或汽维生荐素等节)的脆缺陷界型，昌有些垫基因茄工程慰细胞吐生产标过程咳亦产丢生某拢些抑偿制细踏胞生贡长的隙代谢沾物。赤由此木，在潜培养拿工程姥中应冻考虑圆控制示培养限液营提养成挖分及羞其浓吐度，日同时再采取筐措施轻，消锻除抑昏制细俱胞生般长的约代谢切物，口以保摊证细阔胞正戴常生唐长。治由此宁可见骆，在进基因葛工程嫁细胞腰培养衬过程鸟，除榨—瓣般培刃养条册件外激，必涛需考图虑基赞因工士程细判胞的皆自身最特点猎，确脾定最疮佳培弦养条舱件。弓三、军基因梦工程岸细胞宴的培移养搂租食前已刑述及驰，基病因工篮程细箩胞的丝培养际过程油与一捉般需润氧细山胞培寇养基愉本一串致，植同时言培养姑方式单亦无膏差异妈，可佳采用简各种村分批贷培养较方式位，亦响可采款用连塞续培悼养、竿半连申续培柄养及把透析政培养于等方眼式。没至于告影响浓基因夹工程钻细胞倒培养气的细具胞生静物量跳得率纱与产希物量像的因芒素及括有关鼓参数甘。亦馆可参骄照普巡通细矿胞相彻应培决养方润式求政得。报隶这目前究关于丹动植胡物基伐因工栗程细楼胞培越养工不程的蓝研究倚刚刚析起步凯，有研待进便—庄步发割展。石这里晨仅对肢基因讽工程扮菌的姓营养蓄控制肆、质唉粒稳熄定性两、重毫组质销粒拷摊贝数玩的控秧制及馋表达鬼效率缴作简迫单讨撞论。肌1，割底物缓浓度岁的控挂制部在基靠因工乔程茵风培养石过程努，至桑少要世遵循飞P跑I暖级物本理防则护的兽规定增，因靠此必坚需进铸行菌缘体的垄高密柿度培堵养。淋普通富E．长co烧li皇培养佣时最骗高干乐重菌拉体收枪率可燥达1蝇2．彻5％任，酿插酒酵漆母可灰得1鹅4.郊5%指，浙转枯草使杆菌熟仅可葡得2籍%左梳右。冻根据研这些长结果钟采用如枯草训杆菌盛不太缠合适吉，除算非其螺具有运产物矛的高平效分蚀泌系钓统。优排坦从生抄物安过全性困考虑饭，培蚊养的册基因银工程萝菌通漂常是藏维生佳素或爆氨基亡酸的朱营养巾缺陷饺型突驰变株鸦。培代养过饲程细尤胞对乳维生良素需脚求量嫌甚微肃，在唐培养斯开始顽即加标入必排需量朝对细省胞生先长并歌无影千响，比但培油养一巾开始演即加参入足惹够量撕氨基遵酸则排可能舍因氨雅基酸途浓度铜过大鹅而抑立制细皮胞生漏长。朱在此哄情况有下，成可采应取培掉养过缺程中水，在尖调节背pH锯值同霉时补方加氨依基酸黑混合落物和偷葡萄抱糖的鸡方法晋，以友便培祝养过鬼程葡亭萄糖组及氨口基酸辱浓度牙的基桑本恒遭定，贝从而枕实现席高密湿度培隔养，蝶如副E．脸co国li笨C逗60潮0株镜培养疗时可研获得刻6％基干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