总黄曲霉毒素ELISA定量检测试剂盒研制

总黄曲霉毒素ELISA定量检测试剂盒研制【摘要】目的研究并建立敏感、特异和快速的针对食品中总黄曲霉毒素的ELISA检测方法，形成具有我国自主知识产权的快速定量检测试剂盒。方法在生产抗总黄曲霉毒素单克隆抗体基础上，利用间接竞争ELISA方法，研制出食品中总黄曲霉毒素快速检测试剂盒，并对试剂盒的各项技术参数进行测定。结果该试剂盒对黄曲霉毒素B+G标准品的最低检出浓度为026ng／ml，标准曲线的线性范围为026～2000ng／ml，线性方程y=-04463x+03532(R2=09915)；对黄曲霉毒素B+G50％的抑制浓度为208ng／ml；试剂盒的条内变异系数为418％，条间变异系数为521％，抗体亲和力常数为152×10-10mol／L；对玉米3个加标水平的平均回收率分别为9863％，9456％和11205%；对花生的3个加标水平的平均回收率分别为8866%，8750％和8560％。试剂盒37℃可放置96h以上；试剂盒对黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的交叉反应率分别为100％，575％，104％和19％，与其他真菌毒素无交叉反应。结论研制出的ELIS试剂盒能定量检测食品中总黄曲霉毒素。

【关键词】总黄曲霉毒素

黄曲霉毒素(Aflatoxin)是黄曲霉。同时黄曲霉毒素的毒性具有协同作用，因此，90％以上的国家都制定了食品中总黄曲霉毒素的限量标准。目前总黄曲霉毒素的检测方法主要有薄层层析法、色谱法。我国执行的食品中总黄曲霉毒素B1+B2+G１+G2的国家标准测定方法是薄层色谱法和微柱筛选法，均为目测半定量法，最低检出浓度为5μg/kg〔2〕。这些方法因受本身的限制，精确度低、敏感性差；样品前处理过程复杂费时；或需要价格昂贵的仪器，检测成本高，难以推广应用，影响了粮油食品中黄曲霉毒素的有效监测。酶联免疫吸附法(ELISA)是在免疫学和细胞工程学基础上发展的一种微量检测技术，特别适合于对黄曲霉毒素污染监控中大量样本的筛检。本研究以B细胞杂交瘤技术以能分泌抗总黄曲霉毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株为基础，建立了检测玉米、花生中总黄曲霉毒素的ELISA检测方法，并初步研制出具有我国自主知识产权的ELISA试剂盒。

1材料与方法

11材料

111主要仪器CO2培养箱(美国Queue公司)；洁净工作台(北京半导体设备一厂)；生物倒置显微镜(日本欧林巴斯光学株式会社)；酶标分析仪(瑞士SUNRIS公司）；电子分析天平(瑞士Mettler公司)；低温高速离心机(德国Hermle公司)；电泳仪(美国BIO-RAD公司）等。

112试剂AFB1-BSA、黄曲霍毒素(B+G)(AflatoxinB+G)、黄曲霉毒素B1(AflatoxinB1，AFB1）黄曲霉毒素B2(AflatoxinB2，AFB2)、黄曲霉毒素G1(AflatoxinG1，AFG1)、黄曲霉毒素G2(AflatoxinG2，AFG2)、T-2毒素(T-2toxin)、赭曲霉毒素A(OchratoxinA)、展青霉素(Patulin)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivslenol，DON)、玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)、匙孔嘁血蓝素(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、伏马菌素B1、抗体亚类测定试剂盒(IgM，IgG，IgA，IgD，IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3)；RPMI1640培养基、选择性培养基、福氏佐剂(完全、不完全)、二甲基亚砜(DMSO)、吐温20(Tween20)、聚乙二醇(PEG，MW5000)、青霉素，链霉素(美围Gibco公司）；辣根过氧化物酶羊抗鼠IgG(北京中山试剂公司)；30％H2O2(优级纯，北京化工厂)。

113溶液系统ELISA使用液参考文献［3］制备。

114细胞系与实验动物小鼠骨髓瘤细胞系Sp2／0由本室传代，并经8一氮杂鸟嘌呤处理。雌性BALB／c小鼠，体重18～20g(军事医学科学院实验动物研究所动物繁育场)。

115抗总黄曲霉毒素杂交瘤细胞株本研究室自制。

12方法

121单克隆抗体生产将抗总黄曲霉毒素杂交瘤细胞注入BALB/c小鼠腹腔，获得含抗总黄曲霉毒素单克隆抗体的腹水，并将所得腹水采用饱和硫酸铵盐析法进行纯化〔4〕。

122抗体特性鉴定抗体的免疫球蛋白类别及亚类鉴定采用抗体亚类鉴定试剂盒；抗体的纯度及分子量用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)测定；IgG含量采用二喹呆甲酸蛋白测定试剂盒进行测定；抗体滴度测定采用间接非竞争ELISA方法：以AFB1-BSA为包被抗原，从1：10000倍开始将抗体进行倍比稀释，以Sp2／0细胞培养上清为阴性对照，以(A试验-A空白)／≥21的最大稀释倍数为滴定终点；抗体的特异性和抗体的灵敏度用间接竞争抑制性ELISA法进行测定，参试毒素为黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)、赭曲霉素A(OA)、伏马菌素B1、T-2毒素和载体蛋白BSA。

13试剂盒各项技术参数研究

131方法的检出限(灵敏度)用间接非竞争ELISA法作抗体滴度测定，找出合适的抗体工作浓度。再用间接竞争ELISA法作棋盘滴定，找出合适的包被浓度与毒素的竞争浓度，最后作标准曲线，确定线性范围及检出限。

132方法的回收率试验根据试剂盒的检测范围确定加标浓度，在不含黄曲霉毒素的玉米和花生样品中分别进行高、低2个浓度的加标回收试验，每个加标水平做5个重复的平行样。样品的提取方法为：样品粉碎后使其90％通过250～500μm网筛。称取5g加到100ml具塞三角烧瓶中，加入05gNaCl及25ml甲醇水溶液(70：30，v／v)，剧烈震荡30min后过滤。滤液用纯水稀释10倍进行检测。样品中黄曲霉毒素浓度(μg／Kg)=CDX／W。式中：C-酶标板上测的黄曲霉毒素浓度(ng／ml)，根据标准曲线求得；D-样品提取液的体积(ml)；X-稀释倍数；W-样品重量(g)。

132试剂盒稳定性试验对试剂盒稳定性采用37℃加速破坏实验进行研究，将试剂盒分别放置于4℃和37℃，每隔24h进行ELISA测定，测定阴性对照(不加毒素B0)和阳性(即50％的抑制毒素浓度B)的吸光度(A)值，计算两者的比值(B／B0)。当B006个吸光度(A)值，或B／B0

133方法的专一性(特异性)用交叉反应率表示(见抗体特性鉴定)。

134方法的重复性方法的重复性亦即实验室内的变异程度，分别作加标量为2μg/kg和4μg／kg的各5个平行样的回收率，计算其平均回收率和变异系数。

134方法的再现性方法的再现性亦即实验室间的变异程度，3个实验室分别作加标量为2和4μg／kg的各5个重复的回收率，计算3个实验室间的变异系数。

2结果

21单克隆抗体特性鉴定杂交瘤细胞株产生的腹水抗体经纯化后，抗体滴度约为1：256×107，抗体的工作浓度为1：16×106。抗体检测黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2标准毒素的灵敏度分别为025，05，015和1ng／ml。该抗体的亚类为IgG1，抗体的亲和力常数为152×10-10mol／L。抗体的相对分子量约为150KD纯化后IgG浓度为10g／L。抗体与黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的交叉反应分别为100％，575％，104％和19％；与T-2毒素、赭曲霉毒素A、展青霉素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、伏马菌素B1等其他真菌毒素和牛血清白蛋白的交叉反应均01％。

22试剂盒技术参数经过棋盘滴定，抗体的最适工作浓度为1：16×106，AFB1-BSA的最适包被浓度为00625μg／ml。选择黄曲霉毒素(B+G)标准品(0，0026，0052，013，026，052，13，26，52，13，26，52，130，260ng/ml)共14个浓度制作标准竞争校正曲线，线性方程y=-04463x+03532(R2=09915)，最低检出浓度是026ng／ml，标准曲线的线性范围

为026～2000ng／ml，50％的抑制浓度为208ng／ml。试剂盒的条内变异系数为418％，条间变异系数为521％。

23回收率测定对玉米做黄曲霉毒素(B+G)030，210和1040μg／kg3个加标浓度的回收率实验。其中03μ／kg加标回收率的范围为11205％～8804％，平均回收率9863％；21μg／kg加标回收率的范围为813％～8658％，平均回收率9456％，104μg/kg加标回收率的范围为11724％～10904％，平均回收率11205％。对花生做黄曲霉毒素(B+G)050，200和400μg／kg3个加标浓度的回收率实验。其中05μg/kg加标回收率的范围为10375％～7738％，平均回收率8866％；20μg／kg加标回收率的范围为10386％～7567％，平均回收率8750％；40μg/kg加标回收率的范围为9796％～7576％，平均回收率8560％。

24试剂盒稳定性试验经37℃稳定试验，试剂盒在37℃下存放96h，超过96h后其吸光度值开始下降并A06。

25方法的重复性和再现性经ELISA测定其2个加标水平(20～40μg／kg)实验室内变异系数分别是41％和63％；实验室间平均变异系数分别为79％和83％。

26方法的专一性将试剂盒所用抗体与T-2毒素、赭曲霉毒素A、展青霉素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、伏马菌素B1等其他真菌毒素和牛血清白蛋白进行交叉反应试验，其交叉反应率均01％，说明该试剂盒有很好的专一性。

27试剂盒与HPLC方法验证分别使用本研究研制的试剂盒和高效液相色谱方法对玉米、花生盲样同时进行检测，并将2种方法的检测结果进行T检验，P005，说明2种方法对样品的检测结果差异无统计学意义。

3讨论

黄曲霉毒素对人和动物均产生严重的危害，是各国对粮食和饲料重点监控的指标。由于黄曲霉菌株培养物可同时产生AFB1、AFB2、AFG1和AFG2，而且黄曲霉毒素的毒性具有协同作用，因此，检测食品中总黄曲霉毒素的污染水平具有重要意义。本研究在制备出针对黄曲霉毒素B1,B2、G1、G2均有较好的交叉反应并且有较好的灵敏度和特异性的单克隆抗体基础上，研制具有我国自主知识产权的总黄曲霉毒素ELISA检测试剂盒。该试剂盒最低检出浓度为026μg／kg，对样品的最低检出量为15μg／kg，与国外同类试剂盒灵敏度相似。试剂盒所用单克隆抗体与其他参试真菌毒素均无交叉反应，具有较高的特异性。对玉米3个加标水平的平均回收率为9863％，9456％和11205％，对花生的3个加标水平的平均回收率为8866％，8750％和8560％，符合技术要求(70%～120％)。经实验室间验证，此试剂盒再现性和重复性均较好，变异系数均20％。以上技术参数均达到试剂盒的技术要求，而且具有简便、灵敏、快速，特异性好并可同时检测大量样品等优点，值得推广应用。本研究成功地制备出针对黄曲霉毒素(B+G)具有高亲合力、高特异性的单克隆抗体，建立了总黄曲霉毒素的ELISA检测方法并研制出具有我国自主知识产权的总黄曲霉毒素ELISA检测试剂盒，对开展全国性黄曲霉毒素污染调查及制定粮食中总黄曲霉毒素推荐限量标准建议值具有科学价值和应用意义。

【参考文献】

〔1〕