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文档简介
第六章常用分子生物学技术的原理及应用Thepopulartechnologyinmolecularbiology:
principleandapplication第一节分子生物学发展概述分子生物学molecularbiology是在分子水平上研究生物的结构、组织和功能的科学。1950年,Astbury在一次学术报告中,首次提出并使用了分子生物学这一名词术语。医学分子生物学是应用分子生物学技术和理论来阐明人体正常生理活动和病理过程及其调控的分子机理的一门科学。概述一、分子生物学一些重要的理论知识1.分子生物学发展史上一些重要的事件(1)1865年,“遗传学之父”G.Mendel根据豌豆杂交试验结果,创立了遗传因子学说,即遗传的分离律和自由组合律。(2)1903年W.Sutton提出染色体是Mendel遗传单位的载体的概念。(3)1909年,W.Johannsen将这种在染色体上的遗传单位定名为基因(gene)。(4)1910年,现代实验遗传学奠基人TH.Morgan和他的研究生在研究果蝇的遗传规律时发现了基因的连锁律和交换律。(5)1944年,OT.Avery等人(3人)分离出细菌DNA,并发现DNA是携带生命遗传物质的分子。(6)1950年,Astbury在一次演讲中,首次使用了“分子生物学”术语。(7)1953年,Watson和Crick提出了DNA结构的双螺旋模型,揭示了遗传物质自我复制的机制。
(8)1961年至1966年,Nirenberg和Crick等人破译了DNA遗传密码,1966年破译了64个遗传密码。提出了遗传信息由DNA→RNA→蛋白质传递的中心法则。
(9)1969年,JonathanBeckwith及其同事在哈佛大学成功分离出第一个基因。(10)1961年,F.Jacob和J.Monod提出了乳糖操纵子学说。(11)1970年,发现了逆转录酶。(12)自1946年起的20年当中,陆续发现了许多质粒;1968年至1970年又发现了许多限制性内切酶,为DNA体外重组提供了有利工具。(13)1973年,重组DNA技术问世。(14)1986年,K.Mullis等建立了PCR技术(15)1990年,人类基因组计划。DNA的结构、复制、中心法则基本构成单位是核苷酸核苷酸由脱氧核糖、碱基和磷酸构成。碱基分别是腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和胞嘧啶(C)。相邻的两个核苷酸以磷酸二酯键相连进一步盘旋、折叠,形成三级或四级结构
2.一些重要理论importanttheory五碳糖为核糖(不是脱氧核糖);碱基中有尿嘧啶U(uracil)而没有胸腺嘧啶RNA为单链,不是双链,但RNA单链之间相邻的碱基可由氢键作用形成局部双链。DNA存在于细胞核的染色体、线粒体以及染色体以外的质粒中(质粒是一些双链,闭环的DNA分子)。RNA与DNA有如下不同点:
DNA(或RNA)结构给我们的启示①DNA(或RNA)是水溶性的。这是由于含有磷酸基因、羟基和氨基。在核酸提取过程中,我们保留的是水相、而不是有机相。②核酸是两性电离,既带正电荷,又带负电荷。它的等电点(PI)为2~2.5。在中性溶液中带负电荷。对核酸进行电泳时,点样时应点在负极;杂交时选择尼龙膜时,最好选择带正电荷的尼龙膜。(核酸带负电荷,容易吸附到带正电荷的膜上,牢固,不掉)
③DNA在细胞中存在部位不同(细胞核、线粒体、质粒),所以应注意提取方法的不同
④由于DNA空间构象不同,在电泳时迁移率不同。⑤根据碱基互补配对原则,可设计引物和探针杂交。⑥由于DNA的双螺旋结构和RNA易由于分子内氢链作用形成二级结构,所以在进行杂交等反应时,首先应加热变性,破坏二级结构。
在解旋酶的作用下,打开DNA双链在特定的复制起始点以每条DNA链为模板在DNA聚合酶的催化下以4种脱氧核苷酸为前体物,合成一条互补DNA链。DNA的复制称为半保留复制。DNA的复制DNA半不连续复制①PCR技术的原理:在体外要靠温度(90℃以上)打双链,而不是解旋酶,也是以DNA为模板,需要引物,需DNA聚合酶,需要dNTP为前体。PCR与体内(细胞内)DNA复制的最大差异是温度。②检测核分裂指数:在细胞培养中,加入3H标记的dNTP前体物,被细胞摄取后,参与DNA复制,复制速度越快,参入的3H标记的dNTP越多,可用液闪计数仪检测放射性强度,据此判断。DNA的复制给了我们一些启示遗传信息的传递是:
DNA→RNA→多肽(蛋白质)在逆转录酶的作用下,RNA可形成cDNA,然后再由RNA→蛋白质以上就是完整的中心法则理论,亦可称为基因的表达(expression)。中心法则中您心苏法熊则反义拢链转录(t门ra胃ns尘cr抗ip攀ti育on垂)反义至链有意鸡义链转录(t比ra泰ns泳cr士ip盯ti丘on遵)以DN桥A为模性板,达合成RN喘A的过艘程。非模饭板链欢称为善有意切义链奔,而客模板算常称着为反严义链。转录愚的过毯程大件致是饮这样玩的:以DN宇A一条卸链为模板,诱导RN猴A聚合航酶活宏性、RN愤A聚合升酶识定别并结禽合在预转录猪起始旁位点以AT停P、GT病P、CT仆P和UT帝P为前辅体,合成(转录)R锈NA当遇愤到转袄录终止危信号笛时,早转录拖即停贩止。由RN盟A永→蛋白层质的训过程岩,又枕叫翻乡丰译。只奶有聚友合酶II催化柄的反呀应产席物是mR验NA,而鸟只有mR达NA才翻本译成碍蛋白镜质。基因(D蔽NA欠)上三痕个相多邻的览碱基登组成鲁一个铅密码裂子,一贿个密绳码子悄决定贝一种链特定配的氨袄基酸井,共桑有43=6援4个密辛码子逗。在转宅录过想程中碎,基羊因上贱的三继联密梨码子艺转录跪成mR般NA上的继三联家密码古子。mR当NA由核屈内转通移至姨细胞徒浆中参的核助糖体证上,西以三联斗密码观子指站导合华成蛋跃白质。翻译召后的蛋白季质需幸要加卷工修秆饰。中心末法则判给了民我们堂一些泊启示勿:①遗传逝信息酱由DN丝式A上的耍基因予决定毅。一旦颂基因株发生行突变,将鸦最终至导致呀所翻立译的后蛋白尸质发牺生改岁变,铜从而扶导致纪生理峡功能经改变组,甚引至出古现疾吓病,耐如癌质症、耳肥胖泽等。②mR举NA更能忧准确肝简便磁地反态映DN颜A上基躺因所钥携带膊的遗兔传信脚息。因毫此对追基因谎序列但的分姜析,遇常分岗析mR肆NA的序察列即困可。③基因炸的表慈达有多组织代特异颠性,且嫂受许踪蝶多因就素的剑影响冻,使mR蛾NA的表薄达增兴强、谢降低校甚至省关闭希,从公而影胡响机期体正秒常生啄理功椅能,唇甚至怖出现静疾病案。因此常需纲要检淡测mR杀NA的表歼达的递丰度(含量),常警用方鬼法有No闪rt塞he勤rn投bl及ot、RT昏-P俭CR。定逼量(R挂ea易l斑ti解me叼)P添CR等。这里梨需要摧特别辈强调炭:在料检测mR地NA饶(或蛋脖白)表达嗓时,一定屑要先节弄清互该基迈因在转某种萍组织鞠中是茂否有碗表达。④根据佛中心都法则鹿,可探以RN陪A为模粗板,湿在逆驻转录它酶作恒用下贞形成cD卫NA,于然是建卸立了RT扯-P营CR的方课法。⑤根库据mR弯NA的3’端有po尚ly主(A剧)的特飘点,造在进奏行反转腐录时,就苏以po秋ly踏(A败)为模名板设秘计了寒引物宣。并壮且纯化mR突NA的方反法,也槐是根马据po晃ly捉(A炉)的原便理设疑计的歉。⑥根搬据最恩后的滩翻译语蛋白载质去莫向的滥不同缓,建占立不同戚的蛋嚼白质山提取惰方法,如泊在线伍粒体射,在欢细胞轿核、号在细蓄胞浆修、分遍泌到孤血液册中。第二被节被常堂用分编子生抖物学亏技术Mo允le砖cu纠la览r叛Cl渠on防in退gVe摄ct博or色spl烫as扎mi屑dph泡ag望ecD跨NAge烫no衣mi龟c可li构br峡ar执ie牌scD兽NA劝l钱ib坟ra华ri掏esDN添A填li渣ga素ti丑onRe堤co烧mb虹in哈an洪t壶DN描A痕mo掀le害cu般le叼sTr但an嫁sf父or希ma供ti陈onSe节le念ct格io支nch渡ro竖mo朗so领me漏w太al薪ki殊ngmo朱le待cu姐la绿r萄hy舅br读id剥iz楚at彼io删nDN掀A异se级qu厦en差ci扁ngTh悉e附po俱ly校me你ra尸se估c岂ha泥in朱r赚ea供ct搭io逗n叨(P绣CR事)in恢ve国rs孩e战PC备Rre菌ve警rs销e厅tr据an知sc胳ri尽pt用as夹e埋PC恢RQu苦an槐ti兰ta绪ti厅ve驴P株CRas圆ym嫌me页tr逃ic照P泰CRRN卷AiMu孤lt海ip俩le摸x腹PC铺RSo云ut福he级rn乐B毅lo拳tt耐in岛gDN畏A可fin裂ge么rp岁ri抱nt示in描gWe湖st计er篇n椒bl卸ot紫ti你ngNo搅rt任he有rn颈b巴lo绳tt铅in勾gAr滋bi阻tr谢ar除y仿pr抗im著er行P蔑CRfl滋uo漏re野sc讲en辱ce是i拆n抖si栏tu绸h俗yb皱ri养di戴za岂ti虏on撇(删FI费SH捡)Ge再ne畜c挡hi宗p膜or尺D渐NA桨c犁hi肺p本章匀常用烫技术求词汇一垦基艺因工历程与朵分子续克隆(g赵en病et钻ic骡e剪ng吩in循ee支ri杯ng料a尾nd竹m衣ol惊ec关ul灿ar徐c无lo钟ni眨ng魔)Re剖se呈ar呀ch膜c蜘on育te两nt威:ge骗no转mi复c顽li里br守ar阅y,执c爱DN液A叶li悬br倒ar德y,茅g汗en笔e热cl叛on飞in伴g,撞g求en碰e弟ex筋pr谨es通si铲on质,甜ge追ne补r厅eg竖ul时at佣io佛n,钞g颂en堤e扇kn攀oc林ko舱ut一、仓用于芹基因林克隆状的工此具酶(e剩nz橡ym某es什f望or鼻g躺en完e季cl牙on孩in挥g)在生汤物技较术中轮常用的各种工具酶应系指能用父于DN计A和RN捕A分子的切享割、示连接、聚合、反转精录等刷有关漆的各竖种酶系统称气为工动具酶寨。由宿胜主控章制的按限制拨与修丢饰作州用使得省细菌慨避免龟噬菌酱体感袜染,艳如果坡噬菌税体DN厦A没有挖被修眨饰过慰,进淋入宿盲主就摊会被蹦限制病性酶鹿切断摔。如富果被旨修饰扣过,饼其侵闷染细魄菌的签效率俱就提约高。限制亩性内叙切酶懒及由造宿主旅控制院的限别制与块修饰米作用二、炒分子住克隆(M吊ol己ec闯ul赠ar努C骗lo寇ni爬ng买)1.遗V译ec恐to脂rsVe择ct属or盈s:A昼DN肆A悔(a婆p甘la协sm半id北o但r燥a得ph自ag唱e露DN盖A)推t适ha烛t烈se穷rv久es物a拴s堪a椒ca耻rr乒ie股r冬in姨g直en程e赶cl僻on厦in休g垫ex丛pe在ri还me饲nt熊s.质粒市载体底必须们具备言的基存本条再件(i岔)具有鸦复制亡起点(i桑i)具有裂可选利择的逗标记(i槐ii绒)具有送若干甘限制长酶单英一识匀别位吵点(i鸟v)具有颈较小持的分足子量巧和较音高的豪拷贝喊数(v樱)作为是表达窝载体贞还有砖启动达子,躬转录倍、翻歇译信涂号,启终止寺子序汗列等底片段粘。la踢cZTh型e揭st他ru孔ct校io嗓n专of放p益la膏sm急idsc掠re忌en赤c棵lo悉ni凤ng•λ噬菌迎体载窃体:Ch仿ar丽on系列飞,分淘为取浓代型球和插上入型蜡:取代袋型可戴接受20四kb左右应的外喊源DN悼A,适爷合于姿构建基因巨组文谎库。插入译型只杯可接司受10灿kb以内舍的外屿源DN渔A,适宽合于僻构建cD那NA文库。(1)人富工合段成(户一般桑限于款数十惨个核逝苷酸侨的片抵段)其原供理是笑在测告定肽铺链或戚蛋白劲顺序拳的基姥础上第,根夸据遗撒传密耗码推厉测mR嚼NA序列照和DN鱼A序列亡,经舅严格易设计怕、以轮化学纳法合港成DN融A。生淋长激档素释脖放抑比制因耕子、犹胰岛许素、特干扰戴素表迹皮生邀长因狂子等铲基因级都曾召以这脾样的扎方法驱合成示,这拒种合雷成还帐可分材段进羊行,劳继后辫再连堆接。驴但这竭类方建法很难考咳虑遗凯传密柏码简疼并以献及内泉含子的存茫在等蚁问题骗。2、目标厕基因百的获匀得(2承)逆转辫录法刚合成cD闻NA第一轨、二浸条链三、中基因束组DN篮A文库目愉录四、洋染顿色体挥步移是以违不同众个体想或不先同细巧胞来源源的挽基因丝式组片滴段(拍包括mR例NA削-c旬DN疑A、cD鸣NA术-c逝DN拣A、DN炉A-池DN赢A)之贿间,怎在一编定条铜件下礼变性厅、复他性。圆一旦忆某一吹个体泪细胞诵缺失啊了某恢一DN敏A片段特或某mR次NA不正件常表榜达,哈在与深正常残来源麦的DN虫A片段写或正铅常表将达mR宣NA的cD俭NA进行DN搞A-萌DN酷A,cD系NA仓-m裹RN飞A或cD终NA戒-D标NA杂交秩时,肌未缺矮失的革特定DN愈A片段酬或正娇常表黎达的mR炸NA逆转幻玉录而拾合成种的cD冶NA片段抚就会要因没害有与券其同萌源的穗互补员顺序晒而不具形成澡杂交蛮体,悼从而冤出现由部分滴单链他。通去过某樱种方茅法,机将形庙成杂香交双俊链的秃片段嫂排除垫(消艘减)泄,未掌形成海完整训杂交鬼体的DN货A或cD臂NA片段俗分离稼出来钳,即获可得司到相盆应的响片段料或探谜针。五、消减渡杂交一个篇标准俭的克杂隆外安源片非段过建程植物傍转基馋因——抗虫痰棉动物枪转基堡因—生物宋反应漠器二滋分子忙杂交牙与印污迹技踏术Mo筹le农cu拆la朝r骨hy疯br申id尺iz喝at定io捏n丽&逮b挣lo成tt允in精g胡te踪蝶ch犁no笔lo谦gy核酸胞分子垮杂交(n毕uc趋le盗ic桑a扁ci洒d缠hy究br溉id悔iz笨at捡io步n隙)在DN谈A复性役过程猫中,碗把不慢同DN湾A单链妇分子者放在侧同一拆溶液烧中,演或把DN利A与RN娃A放在易一起诱,只穷要在DN毯A或RN题A的单扎链分记子之屿间有足一定累的碱基晒配对关系更,就纹可在充不同害的分宇子之构间形挪成杂化功双链的这野种现馒象。一、料分子攀杂交肤与印摧迹技旗术的闪原理杂交汤的原絮理实铃质是核冈酸分炊子的变性申与复绪性过程复性RN艘ADN父A(一劲)印浓迹技厕术1.具体贝步骤So蔬ut遣he枪rnE令19法75年首陈次应抹用So曾ut捐he筛rnEM智.洞De贡te昆ct慕io荷n竿of浆s味pe久ci础fi辨c鹿se虎qu优en额ce盈s你am闪on迈gDN烈Afr藏ag刃me福nt辟s佩se府pa跳ra邪te臭d稍by愉g复el挡e裤le梳ct悄ro使ph夜or饺es蹄is喝.J诉Mo烟l便Bi薪ol,19药75肝,骂98漠(3泡):灯50厚3-磨51充7.原始猛文献修出处现:(一症)印大迹技价术1.具体响步骤So败ut破he玩rnE救19烛75年首欢次应谜用琼脂铅糖分强离的DN睡A片段→变性盼为单里链→将一浮张NC膜放愉在胶悲上,核上面欺放吸倘水纸劈燕巾→利用毛细舒作用使胶湖中的DN荷A片段顺转移平到NC膜上斥,使毁之成姨为固相片化分猜子。载有DN镜A单链挎分子桶的NC膜可胶在杂鞠交液怒与另万一种DN读A或RN区A分子刊(探艇针)杂交,具独有互里补序蒸列的RN秒A或DN材A结合到存弟在于NC膜的DN绍A分子红上,踪蝶经检祖测分孟析可显现出杂拘交分谱子的区带。2.印迹(b妻lo晃tt探in拉g)定义将存酬在于串凝胶灵中的虹生物熟大分挖子转疏移(设印迹覆)或碗直接研放在鸽固相例化介绩质上事并加悼以检静测分泥析的声技术代。3.应用广泛焰用于DN精A、RN号A、蛋跌白质纱的检棉测4.发展电转镰移印本迹技滤术、真空拍吸引友转移有印迹型等(二行)探壤针技鞠术探针(p爆ro俩be询)的概哗念用来致检测季某一追特定适核苷取酸序淡列或育基因拢序列掩的DN复A片段爹或RN坡A片段探针吃的种策类寡核效苷酸斤探针基因夕组DN诞A探针cD芳NA探针RN闷A探针将探食针与略固定南在NC膜上银的DN育A或RN哲A进行结合反应驼,探载针的尺序列慢如与NC膜上悟的核雾酸序炼列相堂互补裕,就此可结携合到件膜上嘉的相园应区较带,满经放射酒自显在影或其他闲检测能手段就可妨判断袖膜上陕是否岛有同险源的渴核酸铃分子兵存在渠。探针度技术比的概链念二、旬印迹起技术肺的类锦别及创应用(一仔)DN油A印迹则技术(S衔ou睡th净er絮n孟bl拌ot避ti守ng茎)(二车)RN尊A印迹肆技术(N页or驳th洲er纤n姜bl闪ot秋ti意ng恳)(三铺)蛋青白质量的印样迹分姐析(W窗es象te佣rn妖b桥lo枪tt魔in贱g)(一亿)So机ut煤he握rn装b遮lo蛙tt徐in誓gM1210晃×S因SC转移叶缓冲映液Wh拴at誉ma注n滤纸凝胶Wh虑at受ma酷n滤纸纸巾玻璃俩板重物支持物500g12与探腐针同窄源杂伞交的已基因DN吊A片段基因候组DN自ADN嫂A酶切购片段内切酶NC或尼荡龙膜NC膜或蒸尼龙芹膜基因饼组DN寸A的定买性与毅定量首分析朝。如对捷在基堤因组飘中特猾异基壶因的俯定位糊及检设测等捷。重组携质粒替和噬既菌体剪的分疮析。So哥ut堡he车rt挺b港lo背tt饥in狂g用途放射夺自显造影照缘瑞片(二术)RN撇A印迹诉技术(N炕or追th泄er蔑n沃bl汇ot衬ti湖ng罩)相同建点:Al伤wi孔ne舰J归C,et况a默l.野Me绒th误od郑f趋or惯d辨et小ec承ti览on倦o脊f叨sp殊ec奔if遭icRN渡As戒in砖a农ga采ro外se誓g陆el劈燕s陈by验t壤ra辛ns稳fe叫r焰to摧d悬ia缎zo绣be巷nz寒yl牧ox竿ym隆et面hy揭l-鲜pa缩慧pe育r森an青d英hy药br踏id利iz写at朗io朗n瓦wi学th展D涨NA蔬p面ro苹be嫂s.Pr桑oc龙N状at牵l糟Ac榆ad冠S清ci烟U承SA端,19鲜77,绳74趁(1凝2)军:5哑35臂0-买53苍54原始孩文献持出处名称侦相对孟于So抵ut耗he步rn威b笑lo词tt邀in煮g转移柳的是RN甜A转移撤前无新需酶暂切转移瓦效率伏较高变性贵方法不同圣点原理避均为疲毛细处作用葛。(二翠)RN作A印迹畏技术No舒rt箩he掉rn冈b扒lo卫tt兔in作g用途检测膀某一择组织膏或细肾胞中苦已知援的特跳异mR粒NA的表恐达水困平。比较薪不同户组织鹅和细镇胞的魂同一婚基因习的表盆达情奴况。No申rt勾he右rn壤b货lo灾tt程in食g结果由于城基因亏组测蚕序的脚完成熔及基枯因芯什片技绍术的益成熟崭以上滔两种硬技术蚂应用愁的越巴来越继少(三肤)蛋讯白质屠的印舅迹技由术(免疫赛印迹)首先兼将混闯合蛋言白质组用PA扶GE按分御子大阴小分捏开,尿再将厅蛋白贞质转端移到NC膜上焰,蛋唤白质赛的位律置可总保持红在胶钱中的纷原位鲜上。与DN列A和RN孕A印迹依相似颗之处蛋白各质的炉转移环只有决靠电狮转移激。蛋白蛛质的兔检测屠以抗体作探潮针。用碱佳性磷酸版酶(AL项P)、庭辣根袋过氧圆化酶芒(HR苏P)标唇记第梳二抗框体,底物伞显色来检纪测蛋饺白区鼠带的狱信号槽,底室物亦脚可与化学亏发光背剂结合辱以提幼高敏倍感度兵。或用瞒同位牙素标炭记第音二抗鞭体,放射皂自显忧影法检测台蛋白优区带胳的信裳号。与DN露A和RN泄A印迹劳不同续之处We新st鹊er伐n裹bl色ot校ti毫ng应用检测搬样品革中的阔特异祝蛋白娱质的捐存在条。细胞伶中特贩异蛋肃白质皇的定润量分蔑析。蛋白刷质分徒子的捆相互柜作用钱研究坐。We纲st哲er蒜n椅bl分ot血ti韵ng应用SD渴S-善PA摘GE削p义ur梅if边ie风d犁re陡co骄mb汇in咏an查t涨hu搭ma锻n固CK纤2αsu稀bu秘ni厅t鬼an导d精it枣s驾We颗st妻er桃n申bl直ot迎ti搬ng用已柔知的搜特异适抗体扎检测傻目的侧基因工蛋白三种迁印迹胳技术希的比呀较Westernblotting垂直槽Northernblotting水平槽Southernblotting水平槽斑点蕉或狭附线印俊迹(do过t携or丙s纤lo柔t夜bl棉ot刑ti催ng状)原位王杂交(i毁n狭si尺tu典h串yb脚ri估di勉za而ti世on鹊)DN爬A芯片逮技术(D妄NA迷c榴hi显p)其他飘印迹渣技术三PC金R技术叹的原忽理与化应用(Po钥ly所me宣ra唱se篇C梅ha研in宁R讽ea瘦ct被io票n,PC漆R)聚合脱酶链岸反应PC推R技术哗是19金85年由渔美国肥科学滨家Ka玻ry啄B越Mu户ll灵is建立至的体外扩增悠基因让片段贵的方氧法,得它具苏有特致异、烈敏感敌、产诞率高拦、简轰便、棍重复娃性好哑、易篇自动案化等突出乓优点,是党分子消生物醒学技缴术中幸一项刺具有革命触性的配创举。PC业R方法临被美科国Sc捐ie在nc皂e杂志督评为19屈89年的线十大常科技失成就面之一膝,而Ta道q渔DN野A聚合粪酶被评稼选为龟象征19或89年的伐“年摄分子赏”(t钢he题m泥ol喂ec淹ul唐e汽of各y荷ea碌r)。Th贩e坡No冒be浓l撇Pr背iz润e氏in夏C膏he把mi炊st锋ry19才93"f节or修c异on委tr省ib腐ut虏io驰ns齐t惊o澡th鸽e疯de津ve喘lo咳pm盆en拼ts北o伯f荷me娃th夸od护s扮wi韵th扰in那D孝NA恰-b榆as炎ed匙c盆he弹mi太st最ry宽"Mi摇ch裹ae权l片Sm时it请h19勇44肆-19比32拳-腿2薄00恢0La忍J淡ol尿la申,趋CA遥,该US肥AKa牙ry必B软.非Mu尸ll且isUn增iv柜er陷si遇ty箱o插f蛇Br牺it杠is以h称Co揪lu加mb族iaVa眉nc文ou劲ve园r,氧C忽an买ad队a"f哗or迟h脏is略i蜻nv侨en浸ti夕on剂o钢f澡th彩e网po猾ly刮me时ra甘se挂c惹ha见in切r田ea园ct粉io患n(P刻CR心)me松th宴od提""f助or线h镜is术f极un烦da宇me知nt旅al哀c猜on中tr速ib肾ut通io烦ns僻t乓o爸th楚e毕es戚ta属bl免is客hm辨en绩t绝of秃o巾li哨go遵nu夕cl迈eo谜ti鲜de胡-b梢as数ed俯,屿si社te耳-d插ir毅ec旷te田d制mu鸽ta丹ge矿ne配si勿s闯an悬d窃it株s眼de迷ve针lo舅pm般en出t座fo摘r绩pr元ot革ei毙n渠st导ud岔ie伯s"5Pr仙im碍er疑15Pr和im鸣er诱2Cycle2Cycle1555555Te跑mp恶la滔te含D诱NA一、PC向R技术准的工沿作原雕理55555555Cycle355
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