原代神经元培养

神经细胞原代培养

从动物（大鼠或小鼠等）的胚胎或新生动物的脑组织取下某一局部区域，分离细胞，培养在培养容器后不再移植，常称为原代神经细胞培养。

一、培养前准备

1.器械和器皿

器械：外科剪、镊子、虹膜剪等、小剪刀、细镊子和虹膜小刀等

各种金属器械如解剖器械，使用后及时刷洗干净，用酒精棉球擦拭后晾干，或经60℃烘干，以防生锈。由于湿热消毒对手术器械容易可用70－80％酒精浸泡1小时以上消毒。

器皿：玻璃瓶及相应的胶塞或胶木螺旋盖，

用于分装血清、多聚赖氨酸、解剖液、各种盐溶液和培养液等。培养瓶、盖玻片

培养用的盖玻片必须不含铅、不发霉，可用0.2N盐酸浸泡10分钟，用蒸馏水洗2次，每次10分钟，然后移入丙酮或乙醇浸泡10分钟，再用双蒸水洗2次，每次10分钟，烘干待消毒。凡组织学用过的旧盖玻片一般不用。移液管、吸管、烧杯、离心管和培养皿。塑料培养皿（35mm）、塑料培养板（6、24、96孔）。辅助工具：放置试管、吸管和玻璃瓶等的架子。

2.培养基和培养用液的配制

1)

培养基质：有多聚赖氨酸、牛皮胶原和鼠尾胶原。本室目前常用分子量为7-140000多聚赖氨酸（Poly-L-lysine，浓度为0.1mg/ml。

2)

平衡盐溶液：主要以无机盐和葡萄糖配制而成。各种平衡盐溶液主要的不同点在于NaCl的浓度、离子浓度及缓冲系统的不同，可根据实际需要选用适当的平衡盐溶液。

3)

培养液：目前已有现成的干粉出售，按说明书进行配制即可。神经细胞培养需高糖，培养液应含有或加葡萄糖至6g/L。目前培养海马神经元可选用B27无血清培养液。

4)

血清：有胎牛血清、小牛血清和马血清等。分装成小瓶，4℃保存备用（分装前需56℃灭活30分钟）。

5)

胰蛋白酶溶液：用于分离细胞。先用少量灭菌三蒸水将胰蛋白酶粉末溶成糊状，然后补水至2.5%浓度，振荡摇匀，4℃过夜，待完全溶解后用滤器过滤灭菌，并分装成1-2ml冻存。用前以D-Hanks平衡盐水或其他无钙镁离子溶液溶解稀释至0.25%或0.125%。实际使用温度一般为37℃20-30分钟。

6)

解剖溶液：由平衡盐水（D1-无钙镁离子的Puck氏液）、HEPES缓冲液和蔗糖－葡萄糖溶液组成称为D1-SGH。

D1平衡盐水：NaCl8.0g、KCl0.4g、Na2HPO4.7H2O0.045g、KH2PO40.03g、酚红0.0012g、三蒸水50ml。

蔗糖－葡萄糖（SG）：蔗糖7.5g、葡萄糖3g、三蒸水50ml。

HEPES（H，0.352mM）：用25ml左右的三蒸水溶解2.35g的HEPES后，用NaOH或HCl调pH至7.3-7.4，加三蒸水至28ml。

将D1、SG和H三者合在一起并稀释到1000ml即为解剖液，小瓶分装成5ml后置4℃备用。

二、培养细胞操作

1.

涂培养基

一般在细胞培养前1-2天，将使用的塑料培养皿（35mm）、24孔、96孔培养板或消毒的盖玻片涂上一层Poly-L-Llisine，置于超净台中备用。线照射消毒30-50min，超净工作台台面每次实验前要用75％酒精擦洗。然后紫外线淌毒30min。在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线，消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置．否则会遮挡射线降低消毒效果。—些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。

【洗手和着装】原则上和外科手术相同。平时仅做观察不做培养操作时，可穿装细胞培养室内紫外线照射30min的清洁工作服。在利用超净台工作时，因整个前臂要伸入箱内，应着长袖的清洁工作服，并于开始操作前要用75％酒精消毒手。如果实验过程中手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。进入原代培养室需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。

【火焰消毒】在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先要点燃酒精灯或煤气灯。以后一切操作，如按装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。但要注意：金属器械不能在为焰中烧的时间过长，以防退火，烧过的金属镊要待冷却后才能挟取组织，以免造成组织损伤。吸取过营养液后的吸管不能再用火焰烧灼，因残留在吸管头中营养液能烧焦形成炭膜，再用时会把有害物带入营养液中。开启、关闭长有细胞的培养瓶时，火焰灭菌时间要短。防止因温度过高烧死细胞。另外胶塞过火焰时也不能时间长，以免烧焦产生有毒气体，危害培养细胞。

【操作】进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。为拿取方便，工作台面上的用品要有合理的布局，原则上应是右手使用的东西放置在右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中央。工作由始至终要保持一定顺序性，组织或细胞在未做处理之前，勿过早暴露在空气中。同样，培养液在未用前，不要过早开瓶；用过之后如不再重复使用，应立即封闭瓶口直立可增加落菌机会。吸取营养液、PBS、细胞悬液及其它各种用液时，均应分别使用吸管，不能混用，以防扩大污染或导致细胞交叉污染。工作中不能面向操作野讲话或咳嗽，以免唾沫把细菌或支原体带入工作台面发生污染。操作前用酒精擦拭超净台面及双手。手或相对较脏的物品不能经过开放的瓶口上方，瓶口最易污染，加液时如吸管尖碰到瓶口，则应将吸管丢掉。细胞计数

细胞计数法是细胞学实验的一项基本技术。它是了解培养细胞的生长状态．测定培养基、血清、药物等物质生物学作用的重要手段。下面介绍常用的血球计数板计数法。

一、用品

(1)血球计数板，巴氏吸管

(2)0.25％胰蛋白酶溶液，无血清培养液

(3)显微镜

二、步骤

(1)

准备计数板：用酒精清洁计数板及专用盖玻片，然后用绸布轻轻拭干。

(2)

制备细胞悬液；用消化液分散单层培养细胞或直接收集悬浮培养细胞，制成单个细胞悬液。本法要求细胞密度不低于10000个细胞／m1，若细胞数很少，应将悬液离心(1000rpm，2min)，重悬浮于少量培养液中。

(3)

加样：用吸管轻吹打细胞悬液，取少许细胞悬液，在计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液，加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带气泡。

(4)

计数：在显微镜下，用10X物镜观察计数板四角大方格中的细胞数．细胞压中线时，只计左测和上方者，不计右侧和下方者。

(5)

计算：将计算结果代入下式，得出计数结果：

细胞数／毫升原液＝(4大格细胞数之和／4)X104

细胞计数结果乘以稀释倍数即为细胞密度。

三、注意事项

(1)

消化单层细胞时，务求细胞分散良好，制成单细胞悬液。否则会影响细胞计数结果。

(2)

取样计数前．应充