核酸化学医学宣教专家讲座

第7章核酸化学教学目标:

1.掌握核酸和核苷酸基本知识。2.熟悉核酸两性解离性质。3.熟悉DNA变性、复性和分子杂交意义。4.了解DNA芯片概念及应用。教学重点：核酸两性离解及变性、复性与分子杂交。1核酸化学医学宣教专家讲座第1页1869年瑞士科学家Miescher从外科绷带上脓细胞中分离出了称为“核素”有机物，被证实是脱氧核糖核蛋白。1944年美国科学家Avery在离体条件下完成了肺炎球菌转化试验，证实DNA是遗传物质基础。20世纪50年代，前苏联科学家Chargaff发觉DNA碱基配对规律：A=T，G=C；A+G=T+C。1953年Watson和Crick提出了DNA双螺旋结构模型。1960年Crick提出了中心法则。相关核酸研究领域方面，有些人30多人次荣获诺贝尔奖。2核酸化学医学宣教专家讲座第2页核酸分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。DNA主要集中在细胞核内,线粒体、叶绿体、质体中也含有DNA。RNA主要分布在细胞质中，核内含有部分RNA前体。RNA主要分为:rRNA(80%)，tRNA(15%)，mRNA(5%)。DNA是主要遗传物质，在生物体内含有自体和异体催化功效，即自我复制和指导蛋白质生物合成。3核酸化学医学宣教专家讲座第3页一核酸结构DNARNA嘌呤碱腺嘌呤(A)鸟嘌呤(G)腺嘌呤(A)鸟嘌呤(G)嘧啶碱胞嘧啶(C)胸腺嘧啶(T)胞嘧啶(C)尿嘧啶(U)戊糖D-2'-脱氧核糖D-核糖酸磷酸磷酸两种核酸基本化学组成4核酸化学医学宣教专家讲座第4页5核酸化学医学宣教专家讲座第5页6核酸化学医学宣教专家讲座第6页1核苷酸腺嘌呤核苷酸鸟嘌呤核苷酸7核酸化学医学宣教专家讲座第7页

核苷酸由核苷中戊糖C5原子或C3原子上羟基与磷酸连接而成。有核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸两类。胞嘧啶核苷酸尿嘧啶核苷酸8核酸化学医学宣教专家讲座第8页2主要核苷酸衍生物ATP是产能与耗能过程中间媒介。UTP参加单糖相互置换和多糖合成。CTP参加磷脂合成。GTP参加蛋白质合成。

ATP→ADP+30.5kJ/molATP9核酸化学医学宣教专家讲座第9页cAMP(3',5'-环腺嘌呤核苷一磷酸)和cGMP(3',5'-环鸟嘌呤核苷一磷酸)主要功效是作为细胞之间传递信息信使。cAMP和cGMP环状磷酯键是一个高能键。在pH7.4条件下,cAMP和cGMP水解能约为43.9kj/mol,比ATP水解能高得多。cAMP10核酸化学医学宣教专家讲座第10页二RNA结构RNA有三类，各具不一样生物学功效。RNA分子基本结构是一条线性多核苷酸链，由四种核糖核苷酸以3',5'-磷酸二酯键连接而成。RNA分子中核苷酸数目比DNA少得多。mRNA以DNA为模板转录产生，本身又是合成蛋白质模板，将遗传信息从DNA传递给蛋白质。其平均长度为1000~1500个核苷酸，一级结构包含RNA链上核苷酸次序及各个功效部位排列次序。1RNA一级结构11核酸化学医学宣教专家讲座第11页1)原核mRNA结构原核mRNA普通为多顺反子，一条mRNA链含有指导合成几个蛋白质分子信息，能作为翻译出几个蛋白质模板。在原核mRNA分子两端均无特殊结构，在分子内部，一个顺反子编码区是从起始密码AUG开始，到终止密码UAG为止。各个顺反子编码区段之间均含有一段非编码区。在每个顺反子编码区AUG前有段多嘌呤区，称为SD序列，在蛋白质合成时与核糖体结合，起到在核糖体上定位作用。12核酸化学医学宣教专家讲座第12页2)真核mRNA结构真核mRNA为单顺反子，结构模式为5'-帽子-5'非编码区-编码区-3'非编码区-多聚A(polyA)。帽子结构简式为m7GpppNmpNmpNp-。在帽子结构中，m7G与mRNA链形成5',5'-磷酸二酯键反式连接，使mRNA5'末端没有游离磷酸基,而只有2'-OH和3'-OH,这种RNA5'端能对核酸外切酶降解表现出抗性。13核酸化学医学宣教专家讲座第13页存在于全部帽子中存在于帽子1中存在于帽子2中14核酸化学医学宣教专家讲座第14页帽子结构还可能含有帮助核糖体与mRNA结合，促使核糖体在起始密码AUG处正确起始翻译作用。大多数真核mRNA3'末端含有多聚腺苷酸结构，称PolyA尾。PolyA长度为20~200个腺苷酸。其作用是延长mRNA寿命，有利于mRNA穿过核膜，进入细胞质执行其模板功效。15核酸化学医学宣教专家讲座第15页2RNA二级结构1)tRNA二级结构

RNA二级结构是指RNA分子本身回折，链内互补碱基配对形成局部双螺旋区与非配对次序突环相间分布花形结构。每个局部双螺旋区最少有4~6对碱基才能保持稳定。RNA分子中双螺旋构象与A型DNA相类似，普通双螺旋区约占分子碱基数量40%~70%。16核酸化学医学宣教专家讲座第16页17核酸化学医学宣教专家讲座第17页tRNA三叶草结构由以下几部分组成：①反密码环

环上含有三联体反密码子。由7~9个核苷酸组成，在蛋白质合成时，其反密码子是tRNA识别mRNA上密码子功效部位。tRNA普通由70~90个核苷酸组成，各种tRNA一级结构碱基次序和二级结构被测定。tRNA二级结构均呈三叶草形，三个双螺旋区成为三叶草三个叶柄，三个突环形成三个小叶。18核酸化学医学宣教专家讲座第18页②二氢尿嘧啶环

环上含有稀有碱基二氢尿嘧啶，又称D环，由8~12个核苷酸组成。③TyC环

环上含有稀有碱基T和y(假尿嘧啶)，由7个核苷酸组成。④氨基酸臂

由7对碱基组成,其3'末端为CCAOH，为氨基酸结合部位。⑤额外环

由3~18个核苷酸组成。不一样tRNA含有不一样碱基数，故又称为额外环。19核酸化学医学宣教专家讲座第19页3RNA三级结构

RNA二级花型结构深入回折扭曲，使分子内部自由能最小。在二级结构中突环上未配正确碱基，因为RNA链扭曲而与另一环上碱基形成新氢键配对关系，形成立体花型结构。tRNA三级结构为一个倒L型。L型一端为3'-CCA末端，另一端是反密码环，D环和TyC环会合，组成L形拐角。20核酸化学医学宣教专家讲座第20页三DNA结构核酸一级结构是指核酸分子中核苷酸排列次序(碱基次序)，以及核苷酸之间连接方式。DNA分子多核苷酸链是以数量不等四种脱氧核苷酸经过3'-5'磷酸二酯键连接起来。DNA主链骨架是磷酸和脱氧核糖相间排列成长链，碱基挂在戊糖另一侧。DNA分子有两个游离末端：脱氧核糖5'-OH末端(称5'-末端)和脱氧核糖3'-OH末端(称3'-末端)。一级结构书写方向为5'末端→3'末端。1DNA一级结构21核酸化学医学宣教专家讲座第21页不一样DNA分子含有不一样一级结构，即脱氧核苷酸数目不一样，四种碱基百分比不一样，排列次序也不一样。DNA分子中核苷酸排列次序是生物遗传信息贮藏和表现形式，决定生物遗传性状多样性和复杂性。22核酸化学医学宣教专家讲座第22页2DNA二级结构1953年，Watson和Crick在前人研究工作基础上，依据DNA结晶X-衍射图谱和分子模型，提出了著名DNA双螺旋结构模型，并对模型生物学意义作出了科学解释和预测。1)DNA双螺旋结构特点：①DNA分子由两条DNA单链组成。②DNA双螺旋结构是分子中两条DNA单链之间基团相互识别和作用结果。③双螺旋结构是DNA二级结构最基本形式。23核酸化学医学宣教专家讲座第23页①DNA分子由两条多聚脱氧核糖核苷酸链(简称DNA单链)组成。两条链沿着同一根轴平行盘绕，形成右手双螺旋结构。其中两条链方向相反，即一条链方向为5'-3'，而另一条链方向为3'-5'。②含氮碱基位于螺旋内侧，磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直，糖基环平面与碱基环平面成90º角。2)DNA双螺旋结构关键点24核酸化学医学宣教专家讲座第24页③螺旋横截面直径约为2nm，每条链相邻两个碱基平面之间距离为0.34nm，每10个核苷酸形成一个螺旋，其螺距高度为3.4nm。④两条DNA链相互结合以及形成双螺旋力是链间碱基对所形成氢键。碱基相互结合含有严格配对规律，即腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)结合，鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)结合，这种配对关系，称为碱基互补。A和T之间形成两个氢键(A=T)，G与C之间形成三个氢键(C≡G)。⑤在DNA分子中，嘌呤碱基总数与嘧啶碱基总数相等(A+G=C+T)。25核酸化学医学宣教专家讲座第25页26核酸化学医学宣教专家讲座第26页3DNA三级结构DNA三级结构是双螺旋DNA扭曲或再螺旋。一个环形双螺旋DNA分子，假如经过细胞内旋转酶作用，或体外EB染料作用，即可在环形分子内部引进张力。这种新产生张力不能释放到分子外部，只能在DNA分子内部促使原子位置重排，造成双螺旋再螺旋(称超螺旋)。如引进张力方向与原先右手螺旋方向相同，则超螺旋螺旋方向是左手螺旋，称正超螺旋。如引进张力方向与原先右手螺旋方向相反，则超螺旋螺旋方向是右手螺旋，称负超螺旋。所以，正超螺旋是旋紧双螺旋后形成，负超螺旋是放松双螺旋后形成。27核酸化学医学宣教专家讲座第27页生物体内天然存在环形DNA分子，如病毒、细胞器、质粒、细菌染色体等均以负超螺旋形式存在。正超螺旋只在特殊情况下出现，如DNA复制时，复制叉前进方向前面部分，因为局部解链引发右手螺旋方向张力，造成旋紧螺旋后形成正超螺旋。(1)负超螺旋(2)正超螺旋两种超螺旋构象示意图28核酸化学医学宣教专家讲座第28页4染色体结构真核细胞核内染色体是由DNA和组蛋白结合而成复合物，一条染色体只含一个DNA分子。染色体DNA必须经过复杂盘波折叠才能包装到细胞内。染色体中蛋白质分为组蛋白和非组蛋白两大类，组蛋白有5种，含有较多碱性氨基酸，在生理pH条件下带正电荷，与DNA结合紧密。非组蛋白种类很多，多数为酸性蛋白，与DNA结合较涣散。组蛋白、非组蛋白、染色体DNA组装成染色体。29核酸化学医学宣教专家讲座第29页30核酸化学医学宣教专家讲座第30页四核酸理化性质DNA相对分子质量很大，普通在106~1012，制品为白色絮状物。RNA相对分子质量较小，普通在1~10万，制品为白色粉末。DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物同，易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达4%。相对分子质量为100万DNA在水中溶解度为1%。DNA、RNA和核苷酸均难溶于有机溶剂，所以惯用乙醇做沉淀剂，使其从溶液中析出。1溶解性31核酸化学医学宣教专家讲座第31页2核酸两性解离核酸及核苷酸中碱基上有可解离基团，如胞嘧啶N3，嘌呤N1和N7，可接收质子带正电荷。磷酸基团可进行酸性解离带负电荷。核酸和核苷酸为两性化合物，有等电点。尿嘧啶和胸腺嘧啶不能进行碱性解离，其核苷酸不是两性化合物。核酸和核苷酸两性解离性质和等电点，在分离、纯化、分析和制备过程中有主要应用。32核酸化学医学宣教专家讲座第32页3紫外吸收性质嘌呤和嘧啶都有共轭结构，即核苷、核苷酸、NDA、RNA都能吸收240~290nm紫外光。DNA和RNA紫外吸收性质无显著差异，最大吸收峰258nm，最小吸收峰232nm。不一样碱基紫外吸收特征不一样。同一个碱基，在不一样pH条件、不一样波长、吸收值也不一样，据此，可对核酸进行定性和定量测定。33核酸化学医学宣教专家讲座第33页4核酸变性与复性1)变性指核酸分子中双螺旋区碱基对间氢键受某种理化原因作用而破裂，变成单链过程。核酸变性不包括共价键断裂，变性后相对分子质量不变，理化性质发生改变，生物学功效丧失。很多原因能引发核酸变性，如温度升高，介质pH<4或>10，变性剂如脲素或甲酰胺浓度增加等。

34核酸化学医学宣教专家讲座第34页伴伴随核酸变性其紫外吸收值增加现象，称为增色效应。天然DNA紫外吸收A260值，变性后可增加20%~30%，天然RNAA260值，变性后可增加10%左右。变性还可使溶液粘度降低，浮力密度增加。DNA热变性不是伴随温度升高逐步发生，而是当温度到达某一个数值时，在一个很窄温度范围内突然发生并快速完成。DNA变性温度称为DNA熔点，用Tm表示。35核酸化学医学宣教专家讲座第35页DNA热变性曲线和Tm值Tm为增色效应达最大值50%时温度，即DNA溶液温度到达Tm时，有二分之一双链DNA处于解链状态。DNATm值普通在70℃~85℃之间，随分子内G-C对含量，介质中离子强度而有所不一样。G-C相对含量越高,Tm值就越大；离子强度越低，Tm值也低。36核酸化学医学宣教专家讲座第36页2)复性变性DNA在适当条件下，分开两条互补单链恢复碱基配对，重新成为双螺旋，这个过程称为复性。复性后一些理化性质及生物活性也可部分或全部恢复。复性过程中，紫外吸收值降低，这个现象称为减色效应。复性时降温速度必须迟缓，变性DNA从高温迟缓冷却过程称为退火；热变性DNA从变性高温快速冷却至低温(4℃以下)，此过程称为淬火。淬火处理后DNA不能复性。另外，DNA溶液浓度越大，互补DNA片段碰撞机会越多，轻易复性。DNA片段长度越大，DNA内部次序越复杂，互补碱基相遇机会越小，复性越难。37核酸化学医学宣教专家讲座第37页3)分子杂交不一样起源变性DNA，若彼此之间有部分互补核苷酸次序，当他们在同一溶液中进行热变性和退火处理时，能够得到分子间部分配正确缔合双链，这个过程叫分子杂交。分子杂交不但能够发生在单链DNA与DNA之间，而且DNA与RNA之间，不一样起源RNA与RNA之间，也能够进行分子杂交。分子杂交技术当前在分子生物学试验和基因工程技术中被广泛使用，可用来检测DNA或RNA上特定基因或特定功效部位定位和分布。38核酸化学医学宣教专家讲座第38页39核酸化学医学宣教专家讲座第39页五核酸分离和纯化1核酸分离提取普通原理和方法用啤酒厂废弃啤酒酵母为原料提取RNA，作为生产核苷酸原料，提取方法有稀碱法和浓盐法两种。稀碱法是用1%NaOH使酵母细胞壁破裂，核酸从细胞中释放出来，再用HCl中和，离心除去菌体，调pH至等电点，使RNA在等电点时沉淀出来，离心后即可得到粗品。1)核酸工业化生产40核酸化学医学宣教专家讲座第40页浓盐法是在含10%干酵母溶液中，加入NaCl使其终浓度到达10%，然后加热到90℃并抽提3~4h，得到RNA提取液。高浓度NaCl可改变酵母细胞渗透压，有利于RNA从细胞中释放出来。2)活性核酸制备制备具生物活性核酸，要注意预防降解和变性失活。在制备过程中要注意低温(0~4℃)、不过酸pH>4、不过碱pH<10、较高离子强度、温和操作及必需添加核酸降解酶抑制剂等。41核酸化学医学宣教专家讲座第41页2核酸纯化超离心法依据不一样密度分子分布在不一样密度层溶液中原理，建立密度梯度超离心。依据不一样相对分子质量分子在离心时有不一样在沉降速度,建立速度超离心。凝胶电泳

电泳速度取决于分子量、带电荷数和分子形状。柱层析

羟基磷灰石(HA)被用作纯化DNA层析剂。42核酸化学医学宣教专家讲座第42页六DNA芯片DNA芯片是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或直接将大量DNA探针以显微打印方式有序地固化于支持物表面，然后与标识样品杂交，经过对杂交信号检测分析可取得样品遗传信息。惯用计算机硅芯片作为固相支持物，而称为DNA芯片。基片材料、微加工技术和检测方法等都能影响芯片性能，决定芯片类型和用途是以阵列分布传感器分子。经过传感器分子与基因组DNA、cDNA和mRNA杂交而得到这些核酸样品信息。43核酸化学医学宣教专家讲座第43页44核酸化学医学宣教专家讲座第44页①基因诊疗DNA芯片可用于大规模筛查由基因突变所引发疾病。这项技术高度准确性和高度自动化性对于筛查大量样品含有很大优势。

②分析基因组及发觉新基因DNA芯片技术用于基因组研究可将遗传病表型与DNA上特定基因序列联络起来。③DNA芯片用于基因表示研究因为DNA芯片技术可直接测到mRNA种类及丰度，所以它是研究基因表示有力工具。④利用DNA芯片技术进行DNA序列分析

利用杂交谱重建靶DNA序列，可测定较长片段DNA序列。

45核酸化学医学宣教专家讲座第45页

⑤进行后基因组研究经过基因打靶技术产生突变株，然后用DNA杂交，可判定基因表型。DNA芯片技术应用前景是